የኡርሳ ሞኖአሚዶች ግኝት ፣ ባህሪ እና የተግባር መሻሻል በእፅዋት ማይክሮቱቡል ላይ ተጽዕኖ የሚያሳድሩ አዳዲስ የእፅዋት እድገት አጋቾች።

Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን።እየተጠቀሙበት ያለው የአሳሽ ስሪት የተወሰነ የሲኤስኤስ ድጋፍ አለው።ለተሻለ ውጤት፣ አዲሱን የአሳሽዎን ስሪት እንዲጠቀሙ እንመክርዎታለን (ወይም የተኳኋኝነት ሁነታን በInternet Explorer ውስጥ ያሰናክሉ)።እስከዚያው ድረስ ቀጣይነት ያለው ድጋፍን ለማረጋገጥ ጣቢያውን ያለ ቅጥ ወይም ጃቫስክሪፕት እያሳየን ነው።
የተፈጥሮ ምርቶች ግኝት እና ጠቃሚ አጠቃቀም የሰውን ህይወት ለማሻሻል ይረዳል.የእጽዋት እድገትን የሚከላከሉ ኬሚካሎች አረሞችን ለመቆጣጠር እንደ አረም ኬሚካል በሰፊው ጥቅም ላይ ይውላሉ.የተለያዩ አይነት ፀረ-አረም መድኃኒቶችን መጠቀም አስፈላጊ በመሆኑ አዳዲስ የአሠራር ዘዴዎች ያላቸውን ውህዶች መለየት ያስፈልጋል.በዚህ ጥናት ውስጥ፣ ከስትሬፕቶማይሴስ ዌራንሲስ MK493-CF1 ልቦለድ N -alkoxypyrrole ውህድ፣ኮማሞናሚድ አግኝተናል እና የተሟላውን የማዋሃድ ሂደት አቋቋምን።በባዮሎጂካል እንቅስቃሴ ትንተና፣ ዩርስ-ሞኖአሚክ አሲድ የኡርስ-ሞኖአሚድ ሰራሽ መሃከለኛ እና አቅም መሆኑን ደርሰንበታል።የእፅዋት እድገት መከላከያ.በተጨማሪም የሄላ ሴሎችን እድገት ላይ አሉታዊ ተጽእኖ ሳያሳድር ከፍተኛ የአረም ማጥፊያ እንቅስቃሴ ያለውን urbenyloxyderivative (UDA) ጨምሮ የተለያዩ urbenonic acid ተዋጽኦዎችን አዘጋጅተናል።በተጨማሪም urmotonic አሲድ ተዋጽኦዎች ተክል microtubules የሚረብሽ መሆኑን አገኘ;በተጨማሪም KAND የአክቲን ፋይበርን ይነካል እና የሕዋስ ሞትን ያስከትላል;እነዚህ ሁለገብ ተጽእኖዎች ከሚታወቁት ማይክሮቱቡል አጋቾቹ ይለያያሉ እና ለኡርሶኒክ አሲድ አዲስ የአሠራር ዘዴን ይጠቁማሉ, ይህም በአዳዲስ ፀረ-አረም ኬሚካሎች እድገት ውስጥ ጠቃሚ ጠቀሜታን ይወክላል.
ጠቃሚ የተፈጥሮ ምርቶችን እና ውጤቶቻቸውን ማግኘት እና ተግባራዊ አተገባበር የሰውን ሕይወት ጥራት ለማሻሻል ዘዴ ነው።በጥቃቅን ተሕዋስያን፣ በእጽዋት እና በነፍሳት የሚመረቱ ሁለተኛ ደረጃ ሜታቦሊቲዎች በመድኃኒት እና በግብርና ላይ ትልቅ እድገት አስገኝተዋል።ብዙ አንቲባዮቲክ እና ፀረ-ሉኪሚያ መድኃኒቶች ከተፈጥሯዊ ምርቶች ተዘጋጅተዋል.በተጨማሪም, የተለያዩ ዓይነቶችፀረ-ተባይ መድሃኒቶችከእነዚህ የተፈጥሮ ምርቶች ውስጥ ፀረ-ፈንገስ እና ፀረ-አረም መድኃኒቶች ለግብርና ጥቅም ላይ ይውላሉ.በተለይም በዘመናዊ ግብርና ውስጥ የአረም ማጥፊያ ፀረ አረም ኬሚካሎች የሰብል ምርትን ለመጨመር ጠቃሚ መሳሪያዎች ናቸው, እና የተለያዩ አይነት ውህዶች ቀድሞውኑ ለገበያ ጥቅም ላይ ይውላሉ.እንደ ፎቶሲንተሲስ ፣ አሚኖ አሲድ ሜታቦሊዝም ፣ የሕዋስ ግድግዳ ውህደት ፣ የ mitosis ቁጥጥር ፣ የፋይቶሆሞን ምልክት ወይም የፕሮቲን ውህደት ያሉ በእፅዋት ውስጥ ያሉ በርካታ ሴሉላር ሂደቶች የአረም መድኃኒቶች ዓይነተኛ ዒላማ ተደርገው ይወሰዳሉ።የማይክሮቱቡል ተግባርን የሚከለክሉ ውህዶች የ mitotic regulation2 ላይ ተጽዕኖ በማድረግ የእጽዋት እድገትን የሚነኩ የተለመዱ የአረም መድኃኒቶች ክፍል ናቸው።
ማይክሮቱቡሎች የሳይቶስክሌት አካላት ናቸው እና በ eukaryotic ሕዋሳት ውስጥ በሰፊው ተጠብቀው ይገኛሉ።የ tubulin heterodimer α-ቱቡሊን እና β-tubulin የመስመራዊ ማይክሮቱቡል ፕሮቶፊልሞችን ያቀፈ ሲሆን 13 ፕሮቶፊልሞች የሲሊንደራዊ መዋቅር ይመሰርታሉ።ማይክሮቱቡሎች በእጽዋት ሴሎች ውስጥ በርካታ ሚናዎችን ይጫወታሉ, ይህም የሕዋስ ቅርፅን, የሕዋስ ክፍፍልን እና የውስጠ-ህዋስ ማጓጓዣን መወሰንን ጨምሮ3,4.የእጽዋት ሴሎች ከኢንተርፋዝ ፕላዝማ ሽፋን ስር ያሉ ማይክሮቱቡሎችን ይይዛሉ እና እነዚህ ኮርቲካል ማይክሮቱቡሎች የሚባሉት የሴሉሎስ ማይክሮፋይብሪሎችን አደረጃጀት በሴሉሎስ ሲንታሴስ ኮምፕሌክስ 4,5 ቁጥጥር እንደሚቆጣጠሩ ይታሰባል.የስር ጫፍ በፍጥነት እንዲራዘም ዞን ውስጥ የሚገኙት ኮርቲካል ማይክሮቱቡሎች የስር ጫፉ ጫፍ ላይ የሚገኙ ሲሆን ሴሉሎስ ማይክሮፋይበርስ እነዚህን ማይክሮ ፋይበር ተከትለው የሕዋስ ማስፋፊያ አቅጣጫን ይገድባሉ በዚህም anisotropic ሴል እንዲራዘም ያደርጋል።ስለዚህ, የማይክሮቱቡል ተግባር ከእጽዋት ሞሮሎጂ ጋር በቅርበት የተያያዘ ነው.በጂኖች ውስጥ የሚገኙት የአሚኖ አሲድ ምትክ ቱቡሊን የኮርቲካል ማይክሮቱቡል ድርድሮችን እና የግራ ወይም የቀኝ ጎን እድገትን በአረብኛ 6፣7 ያስከትላሉ።በተመሳሳይ፣ የማይክሮቱቡል-ተያያዥ ፕሮቲኖች ሚውቴሽን የማይክሮቱቡል ተለዋዋጭነትን የሚቆጣጠሩት ደግሞ የተዛባ ሥር እድገትን ያስከትላል8,9,10,11,12,13.በተጨማሪም፣ እንደ ዲስኦፒራሚድ፣ እንዲሁም ፕሪቲላክሎር በሚባለው በማይክሮ ቲዩቡል የሚረብሹ ፀረ-አረም መድኃኒቶችን ማከም እንዲሁም በግራ በኩል ያለው ገደላማ ሥር እድገትን ያስከትላል14።እነዚህ መረጃዎች እንደሚያመለክቱት የማይክሮቱቡል ተግባርን በትክክል መቆጣጠር የዕፅዋትን እድገት አቅጣጫ ለመወሰን ወሳኝ ነው።
የተለያዩ የማይክሮ ቲዩቡል አጋቾች የተገኙ ሲሆን እነዚህ መድሃኒቶች ለሳይቶስክሌትታል ምርምር እንዲሁም ለግብርና እና ለመድኃኒትነት ከፍተኛ አስተዋጽኦ አበርክተዋል.በተለይም ኦሪዛሊን, ዲኒትሮኒሊን ውህዶች, ዲሶፒራሚድ, ቤንዛሚድ-ነክ ውህዶች እና አናሎግዎቻቸው የማይክሮቱቡል ተግባርን ሊገታ እና የእፅዋትን እድገትን ሊገታ ይችላል.ስለዚህ እንደ ፀረ-አረም መድኃኒቶች በሰፊው ጥቅም ላይ ይውላሉ.ነገር ግን ማይክሮቱቡሎች የእጽዋት እና የእንስሳት ህዋሶች አስፈላጊ አካል ስለሆኑ አብዛኛዎቹ ማይክሮቱቡል አጋቾች ለሁለቱም የሕዋስ ዓይነቶች ሳይቶቶክሲክ ናቸው።ስለዚህ, እንደ ፀረ-አረም መድኃኒቶች እውቅና ቢኖራቸውም, የተወሰኑ ፀረ-ተህዋስያን ወኪሎች ለተግባራዊ ዓላማዎች ጥቅም ላይ ይውላሉ.
ስትሬፕቶማይሲስ የኤሮቢክ፣ ግራም-አወንታዊ፣ ፋይላሜንትስ ባክቴሪያን የሚያጠቃልል እና ሰፊ ሁለተኛ ደረጃ ሜታቦላይትስ በማምረት ችሎታው የሚታወቀው የስትሮፕማይሲስ ቤተሰብ ዝርያ ነው።ስለዚህ, አዲስ ባዮሎጂያዊ ንቁ የተፈጥሮ ምርቶች በጣም አስፈላጊ ከሆኑ ምንጮች አንዱ ነው ተብሎ ይታሰባል.አሁን ባለው ጥናት ውስጥ ከስትሬፕቶማይሴስ ዌራንሲስ MK493-CF1 እና S. werraensis ISP 5486 ተነጥሎ coumamonamide የሚባል አዲስ ውህድ አግኝተናል። spectral analysis እና full spectral analysis በመጠቀም የ coumamonamide አወቃቀሩ ተለይቶ የሚታወቅ ሲሆን ልዩ የሆነው N-alkoxypyrrole አጽም ነው። ተብሎ ተወስኗል።ውህደት.የኡርሰሞኒክ አሲድ፣ የኡርሰሞኖአሚድ እና ተዋጽኦዎቹ ሰው ሰራሽ መካከለኛ፣ የታዋቂውን ሞዴል ተክል አረቢዶፕሲስ ታሊያና እድገትን እና ማብቀልን የሚገታ ሆኖ ተገኝቷል።በመዋቅር እና በተግባራዊ ግንኙነት ጥናት፣ ከC9 ጋር ወደ ursonic አሲድ የተቀየረ ውህድ፣ የኡርሶኒክ አሲድ ኖኖሎክሲድ ዲሪቭቲቭ (KAND) ተብሎ የሚጠራው በእድገት እና በመብቀል ላይ ያለውን ተፅእኖ በእጅጉ እንደሚያሳድግ ደርሰንበታል።በተለይም፣ አዲስ የተገኘው የእጽዋት እድገት አጋቾች የትምባሆ እና የጉበትዎርት እድገት ላይ ተጽእኖ ያሳድራሉ እናም ለባክቴሪያ ወይም ለሄላ ሴሎች ሳይቶቶክሲክ አልነበረም።ከዚህም በላይ አንዳንድ የ urmotonic acid ተዋጽኦዎች የተዛባ ሥር phenotypeን ያስከትላሉ, ይህም እነዚህ ተዋጽኦዎች በቀጥታም ሆነ በተዘዋዋሪ ማይክሮቱቡል ላይ ተጽዕኖ ያሳድራሉ.ከዚህ ሃሳብ ጋር በሚስማማ መልኩ፣ በክትባት መከላከያ ወይም በፍሎረሰንት ፕሮቲኖች የተለጠፈ የማይክሮ ቲዩቡልስ ምልከታ እንደሚያሳየው የ KAND ሕክምና ማይክሮቱቡሎችን ያስወግዳል።በተጨማሪም የኩማሞቶኒክ አሲድ ተዋጽኦዎች ሕክምና የአክቲን ማይክሮ ፋይሎርን ረብሸዋል.ስለዚህ፣ ልዩ የሆነ የድርጊት ዘዴው የሳይቶስስክሌትን መጥፋትን የሚያካትት አዲስ የእፅዋት እድገት ተከላካይ አግኝተናል።
ውጥረት MK493-CF1 በሺናጋዋ-ኩ፣ ቶኪዮ ውስጥ ካለው አፈር ተለይቷል።ውጥረት MK493-CF1 ጥሩ ቅርንጫፎች ያሉት ስትሮማል mycelium ፈጠረ።የ 16S ribosomal አር ኤን ኤ ጂን (1422 bp) ከፊል ቅደም ተከተል ተወስኗል።ይህ ውጥረቱ ከ S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: ዓይነተኛ ውጥረት, 99.93%) ጋር በጣም ተመሳሳይ ነው.በዚህ ውጤት ላይ በመመስረት, ይህ ዝርያ ከኤስ.ስለዚህ፣ ይህንን ዝርያ በጊዜያዊነት S. werraensis MK493-CF1 ብለን ሰይመናል።S. werraensis ISP 5486T እንዲሁ ተመሳሳይ ባዮአክቲቭ ውህዶችን ይፈጥራል።ከዚህ ረቂቅ ተሕዋስያን የተፈጥሮ ምርቶችን ለማግኘት ቀደምት ምርምር ትንሽ ስለነበረ ተጨማሪ የኬሚካል ምርምር ተካሂዷል.ኤስ ወረረንሲስ MK493-CF1 በገብስ መካከለኛ ላይ በጠንካራ-ግዛት መፍላት በ 30 ° ሴ ለ 14 ቀናት ከተመረተ በኋላ መካከለኛው በ 50% EtOH ተመርቷል.59.5 ሚሊ ግራም ድፍድፍ ለማውጣት 60 ሚሊ ሊትር ናሙና ደርቋል.የድፍድፍ ማውጫው N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1፣ የተሰየመ coumamonamide፣ 36.0 mg) ለመስጠት ወደ ደረጃ HPLC ተገልብጧል።አጠቃላይ የ 1 መጠን በግምት 60% የሚሆነው የድፍድፍ ምርት ነው።ስለዚህ, የkumamotoamide 1 ባህሪያትን በዝርዝር ለማጥናት ወስነናል.
Coumamonamide 1 ነጭ የአሞርፎስ ዱቄት እና ከፍተኛ ጥራት ያለው የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ (HRESIM) C6H8N2O2 (ምስል 1) ያረጋግጣል.የዚህ ውህድ C2-የተተካው የፒሮል ቁራጭ በδH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH በ 1H NMR spectrum: 4.5 Hz) ተለይቶ ይታወቃል. , H-5) እና δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) እና 13C NMR ስፔክትረም አራት sp2 የካርቦን አቶሞች መኖራቸውን ያሳያል.በ C2 ቦታ ላይ የአሚድ ቡድን መኖሩ በኤችኤምቢሲ ከ C-3 ፕሮቶን ወደ አሚድ ካርቦንዳይል ካርቦን በ δC 161.1 መካከል ባለው ግንኙነት ተገምግሟል።በተጨማሪም, 1 H እና 13 C NMR በ δH 4.10 (3H, S) እና δC 68.3 ላይ የ N-methoxy ቡድኖች በሞለኪውል ውስጥ መኖሩን ያመለክታሉ.እንደ የተሻሻለ ልዩነት ስፔክትሮስኮፒ እና የኒውክሌር ኦቨርሃውዘር ምህጻረ ቃል (NOEDF) የመሳሰሉ የእይታ ትንታኔዎችን በመጠቀም የሜቶክሲ ቡድኑ ትክክለኛ ቦታ ገና አልተገለጸም N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide የመጀመሪያው እጩ ውህድ ሆኗል።
የ 1 ትክክለኛውን መዋቅር ለመወሰን, አጠቃላይ ውህደት ተካሂዷል (ምስል 2 ሀ).በገበያ ላይ የሚገኘው 2-aminopyridine 2 በ m-CPBA የሚደረግ ሕክምና ተመጣጣኝ N-oxide 3ን በቁጥር ምርት አስገኝቷል።ከ 2-aminoazidation 2 በኋላ, በአብራሞቪች የተገለፀው የሳይክሎኮንዳሽን ምላሽ በ 90 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ውስጥ በቤንዚን ውስጥ የተፈለገውን 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 ግራም ለማግኘት.ፍጥነት 60% (ሁለት ደረጃዎች).15፣16።Methylation እና hydrolysis 4 ከዚያም 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic አሲድ ("cumotonic አሲድ" ይባላል, 6) ጥሩ ምርት (70%, ሁለት እርምጃዎች) ሰጥቷል.በመጨረሻም፣ በአሲድ ክሎራይድ መካከለኛ 6 በኩል የውሃ አሞኒያን በመጠቀም ኩማሞቶ አሚድ 1ን ከ98% ምርት ሰጥቷል።የተቀናበረው 1 ሁሉም የእይታ መረጃ ከተገለለ 1 ጋር ተመሳሳይ ነው ፣ ስለሆነም የ 1 አወቃቀር ተወስኗል ።
የ urbenamide እና urbenic አሲድ ባዮሎጂያዊ እንቅስቃሴ አጠቃላይ ውህደት እና ትንተና.(ሀ) የኩማሞቶ አሚድ አጠቃላይ ውህደት።(ለ) የሰባት ቀን እድሜ ያለው የዱር አረቢዶፕሲስ ኮሎምቢያ (ኮል) ችግኞች በ Murashige እና Skoog (MS) ሳህኖች ላይ coumamonamide 6 ወይም coumamonamide 1 በያዙት መጠቆሚያዎች ላይ ይበቅላሉ።የመጠን አሞሌ = 1 ሴ.ሜ.
በመጀመሪያ የ urbenamide እና መካከለኛዎቹ የእጽዋት እድገትን የመቀየር ችሎታ ያላቸውን ባዮሎጂያዊ እንቅስቃሴዎች ገምግመናል።የተለያዩ የursmonamide 1 ወይም ursmonic acid 6 ወደ MS agar media እና cultured Arabidopsis thaliana ችግኞች በዚህ ሚዲያ ላይ ጨምረናል።እነዚህ ጥናቶች እንደሚያሳዩት ከፍተኛ መጠን ያለው (500 μM) የ 6 ሥር እድገትን ይከለከላል (ምስል 2 ለ).በመቀጠል፣ የN1 6 ቦታን በመተካት የተለያዩ ተዋጽኦዎችን ፈጥረናል እና የመዋቅር–እንቅስቃሴ ግንኙነት ጥናቶችን አደረግን (የአናሎግ ውህደት ሂደት በደጋፊ መረጃ (SI) ውስጥ ተገልጿል)።የአረቢዶፕሲስ ችግኞች 50 μM ursonic acid ተዋጽኦዎች በያዙ መካከለኛ ላይ ይበቅላሉ እና የስር ርዝመቱ ተለካ።በሥዕሉ ላይ እንደሚታየው.በስእል 3a, b እና S1 ላይ እንደሚታየው ኮማሞ አሲዶች በ N1 አቀማመጥ ላይ የተለያየ ርዝመት ያላቸው የመስመር አልኮክሲ ሰንሰለቶች (9, 10, 11, 12, እና 13) ወይም ትልቅ የአልኮክሲ ሰንሰለቶች (15, 16 እና 17) አላቸው.ተዋጽኦዎቹ የስር እድገትን በከፍተኛ ሁኔታ መከልከልን አሳይተዋል።በተጨማሪም, የ 200 μM 10, 11, ወይም 17 አተገባበር ማብቀል የተከለከለ ነው (ምስል 3c እና S2).
የኩማሞቶ አሚድ እና ተዛማጅ ውህዶች አወቃቀር-እንቅስቃሴ ግንኙነት ጥናት።(ሀ) የአናሎግ አወቃቀር እና ውህደት እቅድ።(ለ) በኤምኤስ መካከለኛ ላይ ከ 50 μM ኮማሞናሚድ ተዋጽኦዎች ጋር ወይም ያለሱ የሚበቅሉትን የ 7 ቀን እድሜ ያላቸውን ችግኞች የስር ርዝመት መጠን መለየት።ኮከቦች በሻም ህክምና (t test, p<0.05)n>18. መረጃ እንደ አማካኝ ± ኤስዲ ነው የሚታየው።nt ማለት "ያልተፈተነ" ማለት ነው ምክንያቱም ከ 50% በላይ የሚሆኑት ዘሮች አልበቀሉም.(ሐ) ለ 7 ቀናት በኤምኤስ መካከለኛ ከ 200 μM ኮምሞናሚድ እና ተዛማጅ ውህዶች ጋር የተከተፉ የታከሙ ዘሮች የመብቀል መጠን መጠን።ኮከቦች በሻም ህክምና (ቺ-ስኩዌር ፈተና) ከፍተኛ ልዩነቶችን ያመለክታሉ.n=96.
የሚገርመው ነገር፣ ከC9 በላይ የሚረዝሙ የአልኪል የጎን ሰንሰለቶች መጨመር የመከላከል እንቅስቃሴን ይቀንሳል፣ ይህም ከኩምሞቶይክ አሲድ ጋር የተያያዙ ውህዶች ባዮሎጂካዊ ተግባራቸውን ለማሳየት የተወሰነ መጠን ያለው የጎን ሰንሰለቶች እንደሚያስፈልጋቸው ይጠቁማል።
የመዋቅር እና የተግባር ግንኙነት ትንተና C9 ወደ ursonic አሲድ የተቀየረ እና የኡርሶኒክ አሲድ ኖኖሎክሲስ ተዋጽኦ (ከዚህ በኋላ KAND 11 እየተባለ የሚጠራው) በጣም ውጤታማ የሆነው የእፅዋት እድገት ተከላካይ በመሆኑ የ KAND 11 የበለጠ ዝርዝር ባህሪን አቅርበናል። የአረብኛ ህክምና በ 50 μM KAND 11 ከሞላ ጎደል ሙሉ በሙሉ እንዲበቅሉ ይከላከላል ነገር ግን ዝቅተኛ መጠን (40, 30, 20, ወይም 10 μM) የ KAND 11 መጠን ሥር እድገትን በመጠን-ጥገኛ መንገድ (ምስል 4a, b).KAND 11 የ root meristem አዋጭነት ላይ ተጽእኖ ያሳድራል እንደሆነ ለመፈተሽ በፕሮፒዲየም አዮዳይድ (PI) የተበከሉትን ስርወ ሜሪስተም መርምረናል እና የሜሪስተም አካባቢን መጠን ለካን።25 μM KAND-11 በያዘው መካከለኛ ላይ የበቀለው የችግኝ መጠን 151.1 ± 32.5 μm ሲሆን ዲኤምኤስኦን በያዘ መቆጣጠሪያ መካከለኛ ላይ የበቀለው የችግኝ መጠን 264.7 ± 30.8 μm (ምስል 4c, d) , ይህም KAND-11 ሴሉላር እንቅስቃሴን ወደነበረበት እንደሚመልስ ያመለክታል.ማሰራጨት.ሥር ሜሪስቴም.ከዚህ ጋር በሚስማማ መልኩ የ KAND 11 ህክምና የሴል ዲቪዥን ምልክት CDKB2; 1p :: CDKB2; 1-GUS ምልክት በስር ሜሪስቴም (ምስል 4e) 17 ቀንሷል.እነዚህ ውጤቶች እንደሚያመለክቱት KAND 11 የሴል ስርጭት እንቅስቃሴን በመቀነስ የስር እድገትን ይከለክላል.
የ urbenonic አሲድ ተዋጽኦዎች (urbenyloxyderivatives) እድገት ላይ inhibitory ውጤት ትንተና.(ሀ) የ 7 ቀን እድሜ ያላቸው የዱር አይነት ኮል ችግኞች በኤምኤስ ሳህኖች ላይ የሚበቅሉ በ KAND 11. ስኬል ባር = 1 ሴ.ሜ.(ለ) የሥሩ ርዝመት መጠን።ደብዳቤዎች ጉልህ ልዩነቶችን ያመለክታሉ (የቱኪ HSD ሙከራ ፣ ገጽ<0.05)n>16. መረጃ እንደ አማካኝ ± ኤስዲ ነው የሚታየው።(ሐ) 25 μM KAND ያላቸው ወይም ያለሱ በኤምኤስ ሰሌዳዎች ላይ የሚበቅሉ የፕሮፒዲየም አዮዳይድ ቀለም ያላቸው የዱር ዓይነት ኮል ሥሮች ኮንፎካል ማይክሮስኮፒ 11. ነጭ ቅንፎች ሥር ሜሪስተም ያመለክታሉ።የመጠን አሞሌ = 100 µm(መ) የስር ሜሪስቴም መጠን (n = 10 እስከ 11) መጠናቸው።የስታቲስቲክስ ልዩነቶች በቲ-ሙከራ (ገጽ<0.05)አሞሌዎቹ አማካይ የሜሪስተም መጠንን ይወክላሉ።(ሠ) የCDKB2 ግንባታን የያዘ የስር ሜሪስተም ልዩነት (ዲአይሲ) አጉሊ መነጽር;1ፕሮ፡ CDKB2;1-GUS በ25 μM KAND ምርመራ በኤምኤስ ሰሌዳዎች ላይ በሚበቅሉ የ5-ቀን ችግኞች ላይ ቆሽሸዋል።
የ KAND 11 phytotoxicity ሌላ ዲኮቲሌዶኖስ ተክል ትንባሆ (Nicotiana tabacum) እና ዋና የመሬት ተክል ሞዴል ኦርጋኒክ, liverwort (Marchantia polymorpha) በመጠቀም ተፈትኗል.እንደ አረቢዶፕሲስ ሁኔታ፣ ትንባሆ SR-1 መካከለኛ ላይ የሚበቅሉት 25 μM KAND 11 የያዙ አጫጭር ስሮች (ምስል 5 ሀ)።በተጨማሪም 200 μM KAND 11 በያዙ ከ48ቱ ዘሮች 40 ያህሉ የተበቀሉ ሲሆን ሁሉም 48ቱ ዘሮች በፌዝ በሚታከሙ ሚዲያዎች ላይ የበቀሉ ሲሆን ይህም ከፍተኛ መጠን ያለው የ KAND ከፍተኛ መጠን ያለው መሆኑን ያሳያል።<0.05;chi test -square) የትምባሆ መበከልን አግዷል።(ምስል 5 ለ)በተጨማሪም የ KAND 11 ክምችት በ liverwort ውስጥ የባክቴሪያ እድገትን የሚገታ በአረቢዶፕሲስ (ምስል 5c) ውስጥ ካለው ውጤታማ ትኩረት ጋር ተመሳሳይ ነው.እነዚህ ውጤቶች KAND 11 የተለያዩ እፅዋትን እድገት ሊገታ እንደሚችል ያመለክታሉ።ከዚያም እንደየቅደም ተከተላቸው የከፍተኛ የእንስሳት እና የባክቴሪያ ህዋሶች ተወካዮች በመሆን ከድብ ሞኖአሚድ ጋር የተገናኙ ውህዶችን በሌሎች ፍጥረታት ማለትም በሰው ሄላ ህዋሶች እና Escherichia coli strain DH5a ላይ ሊኖር የሚችለውን ሳይቶቶክሲክነት መርምረናል።በተከታታይ የሴሎች መስፋፋት ሙከራዎች, coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6, እና KAND 11 በ 100 μM (ምስል 5d,e) መጠን ላይ የሄላ ወይም ኢ.
የ KAND 11 እድገት መከልከል በአረብ-ያልሆኑ ፍጥረታት ውስጥ።(ሀ) የሁለት ሳምንት እድሜ ያላቸው የዱር አይነት SR-1 የትምባሆ ችግኞች 25 μM KAND 11 በያዙ በአቀባዊ በተቀመጡ ኤምኤስ ሳህኖች ላይ ይበቅላሉ። ኤምኤስ ሳህኖች 200 μM KAND 11. (ሐ) የሁለት ሳምንት እድሜ ያለው የዱር አይነት ታክ-1 የጉበትዎርት ቡቃያ በጋምቦርግ B5 ሳህኖች ከተጠቆመው የ KAND 11 መጠን ጋር ይበቅላል። ቀይ ቀስቶች በሁለት ሳምንት ጊዜ ውስጥ ማደግ ያቆሙ ስፖሮችን ያመለክታሉ። ጊዜ.(መ) የሄላ ሴሎች የሕዋስ መስፋፋት ምርመራ።የሕዋስ ቆጠራ ኪት 8 (ዶጂንዶ) በመጠቀም አዋጭ የሆኑ ሕዋሶች ቁጥር በተወሰነ የጊዜ ክፍተት ይለካል።እንደ መቆጣጠሪያ፣ የሄላ ህዋሶች በ 5 μg/ml actinomycin D (Act D) ታክመዋል፣ ይህም የአር ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ ቅጂን ይከለክላል እና የሕዋስ ሞት ያስከትላል።ትንታኔዎች በሶስት እጥፍ ተካሂደዋል.(ሠ) ኢ.የኢ.ኮሊ እድገት OD600 በመለካት ተተነተነ።እንደ መቆጣጠሪያ, ሴሎች በ 50 μg / ml ampicillin (Amp) ተይዘዋል, ይህም የባክቴሪያ ሴል ግድግዳ ውህደትን ይከለክላል.ትንታኔዎች በሶስት እጥፍ ተካሂደዋል.
ከኡራሚድ ጋር በተያያዙ ውህዶች ምክንያት የሚከሰተውን የሳይቶቶክሲክ ድርጊት ዘዴን ለመለየት የ urbenic አሲድ ተዋጽኦዎችን በመጠኑ የመከልከል ውጤቶች መልሰናል።በሥዕሉ ላይ እንደሚታየው.በስእል 2b, 6a ላይ እንደሚታየው በአጋር ሳህኖች ላይ የሚበቅሉ ችግኞች ከፍተኛ መጠን ያለው (200 μM) urmotonic acid 6 አጠር ያሉ እና የግራ ጥምዝ ሥሮች (θ = - 23.7 ± 6.1) ያመርታሉ, በመቆጣጠሪያው ላይ ግን የበቀለ ችግኞች, ችግኞች ከሞላ ጎደል ቀጥ ያሉ ስሮች (θ = - 3.8 ± 7.1) ፈጠሩ።ይህ የባህሪ ግዴለሽ እድገት የሚታወቀው በኮርቲካል ማይክሮቱቡልሶች 14፣18 ስራ መቋረጥ ምክንያት ነው።ከዚህ ግኝት ጋር በሚስማማ መልኩ፣ ማይክሮቱቡል-አስደናቂ መድሐኒቶች ዲስኦፒራሚድ እና ኦሪዛሊን በእድገታችን ሁኔታ ውስጥ ተመሳሳይ ስር እንዲዘጉ ያደርጉ ነበር (ምስል 2 ለ፣ 6 ሀ)።በተመሳሳይ ጊዜ, የኡርሞቶኒክ አሲድ ተዋጽኦዎችን ፈትነን እና የተወሰኑትን መርጠናል, በተወሰኑ ጥራቶች ውስጥ, የግዴታ ሥር እድገትን ያመጣሉ.ውህዶች 8, 9 እና 15 በ 75 μM, 50 μM እና 40 μM ውስጥ የስር እድገትን አቅጣጫ ቀይረዋል, ይህም እነዚህ ውህዶች ማይክሮቱቡል (ስዕል 2b, 6a) በተሳካ ሁኔታ መረጋጋት እንደሚችሉ ያሳያል.እንዲሁም በጣም ኃይለኛ የሆነውን ursolic acid derivative KAND 11ን በትንሽ መጠን (15 μM) ሞከርን እና የ KAND 11 አተገባበር ስርወ እድገትን እንደሚገታ እና ወደ ግራ መዘንበል ቢፈልጉም የስር እድገቱ አቅጣጫ ያልተስተካከለ መሆኑን ደርሰንበታል። ምስል C3)..ከፍተኛ መጠን ያለው የማይክሮ ቱቡል-አስደናቂ መድሐኒቶች አንዳንድ ጊዜ ሥር መውደቅን ከማድረግ ይልቅ የእፅዋትን እድገት ስለሚገቱ፣ በመቀጠል KAND 11 በስር epidermal ሴሎች ውስጥ ያሉ ኮርቲካል ማይክሮቱቡሎችን በመመልከት በማይክሮቱቡል ላይ ተጽዕኖ ሊያሳድር እንደሚችል ገምግመናል።በ 25 μM KAND 11 በሚታከሙ የችግኝ ሥር በሚገኙ የ epidermal ሕዋሳት ውስጥ ፀረ-β-ቱቡሊን ፀረ እንግዳ አካላትን በመጠቀም Immunohistochemistry በ elongation ዞን (ምስል 6 ለ) ውስጥ በ epidermal ሕዋሳት ውስጥ ሁሉም የኮርቲካል ማይክሮቱቡሎች መጥፋት አሳይቷል።እነዚህ ውጤቶች ኩማሞቶኒክ አሲድ እና ተዋጽኦዎቹ እነሱን ለማደናቀፍ በቀጥታም ሆነ በተዘዋዋሪ በማይክሮቱቡል ላይ እንደሚሠሩ እና እነዚህ ውህዶች ልብ ወለድ ማይክሮቱቡል አጋቾች መሆናቸውን ያመለክታሉ።
Ursonic acid እና ተዋጽኦዎቹ በአረቢዶፕሲስ ታሊያና ውስጥ ኮርቲካል ማይክሮቱቡሎችን ይለውጣሉ።(ሀ) በተለያዩ የ urmotonic አሲድ ተዋጽኦዎች በተገኙበት በተጠቆሙት ስብስቦች ውስጥ የሚለካ ስርወ ዘንበል አንግል።ማይክሮቱቡሎችን ለመግታት የታወቁት የሁለት ውህዶች ተጽእኖዎች-ዲስኦፒራሚድ እና ኦሪዛሊን እንዲሁ ተንትነዋል.ውስጠቱ የስር እድገትን አንግል ለመለካት ጥቅም ላይ የዋለውን መስፈርት ያሳያል.ኮከቦች በሻም ህክምና (t test, p<0.05)n>19. የመጠን ባር = 1 ሴ.ሜ.(ለ) ኮርቲካል ማይክሮቱቡሎች በኤፒደርማል ሴሎች ውስጥ በኤክስቴንሽን ዞን ውስጥ.በኤምኤስ ሰሌዳዎች ላይ ከ25 μM KAND 11 ጋር ወይም ያለሱ የሚበቅሉ ማይክሮቱቡሎች የዱር-አይነት አረቢዶፕሲስ ኮል ሥሮች በ β-tubulin ቀዳሚ ፀረ እንግዳ አካላት እና በአሌክሳ ፍሎር የተዋሃዱ ሁለተኛ ፀረ እንግዳ አካላትን በመጠቀም በ immunohistochemical ቀለም ታይተዋል።የመጠን አሞሌ = 10 µm(ሐ) በሥሩ ሜሪስቴም ውስጥ የሚገኙት የማይክሮቱቡሎች ሚቶቲክ መዋቅር።ማይክሮቱቡሎች የበሽታ መከላከያ ኬሚካል ቀለም በመጠቀም ታይተዋል.የፕሮፋዝ ዞኖች፣ ስፒንድስ እና ፍራግሞፕላስትን ጨምሮ ሚቶቲክ አወቃቀሮች ከኮንፊካል ምስሎች ተቆጥረዋል።ቀስቶች ሚቶቲክ ማይክሮቱቡል አወቃቀሮችን ያመለክታሉ።ኮከቦች በሻም ህክምና (t test, p<0.05)n>9. የመጠን አሞሌ = 50 µm.
ምንም እንኳን ኡርሳ የማይክሮቱቡል ተግባርን የማስተጓጎል ችሎታ ቢኖረውም, የእርምጃው ዘዴ ከተለመደው ማይክሮቱቡል ዲፖሊመርዲንግ ኤጀንቶች የተለየ እንደሚሆን ይጠበቃል.ለምሳሌ፣ እንደ ዳይሶፒራሚድ እና ኦሪዛሊን ያሉ የማይክሮቱቡል ዲፖሊሜራይዝድ ኤጀንቶች ከፍ ያለ ክምችት የኤፒደርማል ሴሎች አኒሶትሮፒክ እንዲስፋፋ ያደርጋሉ፣ ነገር ግን KAND 11 አያደርጉም።በተጨማሪም የ KAND 11 እና ዲስኦፒራሚድ በጋራ መተግበር የተቀናጀ የዲስኦፒራሚድ ስርወ እድገት ምላሽ እና የ KAND 11 እድገትን መከልከል ታይቷል (ምስል S4)።እኛ ደግሞ hypersensitive disopyramide 1-1 (phs1-1) ሚውቴሽን ወደ KAND 11 ምላሽ ተንትነዋል. phs1-1 ያልሆኑ ቀኖናዊ tubulin kinase ነጥብ ሚውቴሽን ያለው እና disopyramide9,20 ጋር ሲታከም አጭር ሥሮች ያፈራል.KAND 11 በያዘው በአጋር መካከለኛ ላይ የሚበቅሉት phs1-1 የሚውቴሽን ችግኞች በዲስፒራሚድ ላይ ከሚበቅሉት ጋር ተመሳሳይነት ያላቸው አጫጭር ሥሮች ነበሯቸው (ምስል S5)።
በተጨማሪም በ KAND 11 በሚታከሙ ችግኞች ስር ስር እንደ ፕሮፋዝ ዞኖች፣ ስፒንድስ እና ፍራግሞፕላስት ያሉ ሚቶቲክ ማይክሮቱቡል አወቃቀሮችን ተመልክተናል። በCDKB2;1p ሚቶቲክ ማይክሮቱቡሎች ቁጥር ታይቷል (ምስል 6 ሐ).
የ KAND 11ን ሳይቶቶክሲካዊነት በንዑስ ሴሉላር ጥራት ለመለየት፣ ትንባሆ BY-2 ተንጠልጣይ ሴሎችን በ KAND 11 አከምን እና ምላሻቸውን ተመልክተናል።KAND 11 በኮርቲካል ማይክሮቱቡሎች ላይ የሚያሳድረውን ተጽዕኖ ለመገምገም በመጀመሪያ KAND 11ን ወደ BY-2 ህዋሶች ጨምረነዋል TagRFP-TUA6፣ ፍሎረሰንት በሆነ መልኩ የማይክሮ ቱቡሎች የሚል ስያሜ ይሰጣል።Cortical microtubule density በምስል ትንተና የተገመገመ ሲሆን ይህም በሳይቶፕላስሚክ ፒክሰሎች መካከል ያለውን የሳይቶስክሌትታል ፒክሰሎች በመቶኛ የሚለካ ነው።የምርመራው ውጤት እንደሚያሳየው በ 50 μM ወይም 100 μM KAND 11 ለ 1 ሰዓት ከታከመ በኋላ መጠኑ በከፍተኛ ሁኔታ ወደ 0.94 ± 0.74% ወይም 0.23 ± 0.28% ቀንሷል, በዲኤምኤስኦ የታከሙ የሴሎች ብዛት 1.0034 ± 1.634 ± ነው. % (ምስል 7 ሀ)።እነዚህ ውጤቶች የ KAND 11 ሕክምና የኮርቲካል ማይክሮቱቡል (የኮርቲካል ማይክሮቱቡል) ዲፖሊሜራይዜሽን (ምስል 6 ለ) እንደሚያመጣ በአረቢዶፕሲስ ውስጥ ካለው ምልከታ ጋር ይጣጣማሉ።እንዲሁም የBY-2 መስመርን ከ GFP-ABD ከተሰየመ የአክቲን ፋይበር ጋር ከተመሳሳይ የ KAND 11 ክምችት ጋር ከታከምን በኋላ የ KAND 11 ህክምና የአክቲን ፋይበርን እንደሚያስተጓጉል ተመልክተናል።በ 50 μM ወይም 100 μM KAND 11 ለ 1 ሰአታት የሚደረግ ሕክምና የአክቲን ክር ​​ጥንካሬን ወደ 1.20 ± 0.62% ወይም 0.61 ± 0.26% በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሷል, ነገር ግን በዲኤምኤስኦ የታከሙ ሴሎች ውስጥ ያለው ጥንካሬ 1.69 ± 0.51% ነው.7 ለ)እነዚህ ውጤቶች ከ propyzamide ተጽእኖዎች ጋር ይቃረናሉ, እሱም አክቲን ፋይበርን አይጎዳውም, እና ላትሩንኩሊን ቢ, ማይክሮቱቡሎች ላይ ተጽእኖ የማያሳድር የአክቲን ዲፖሊመርዘር (SI ምስል S6).በተጨማሪም, በ coumamonamide 1, coumamonamide acid 6, ወይም KAND 11 ላይ የሚደረግ ሕክምና በሄላ ሴሎች ውስጥ የሚገኙትን ማይክሮቱቡሎች (SI ምስል S7) ላይ ተጽእኖ አላሳደረም.ስለዚህ, የ KAND 11 የአሠራር ዘዴ ከሚታወቁት የሳይቶስክሌትስ አስጨናቂዎች የተለየ እንደሆነ ይታመናል.በተጨማሪም በካንድ 11 የታከሙ የ BY-2 ህዋሶች በአጉሊ መነጽር ሲታይ በካንድ 11 ህክምና ወቅት የሕዋስ ሞት መጀመሩን ያሳያል እና የኢቫንስ ሰማያዊ ቀለም ያላቸው የሞቱ ሴሎች መጠን ከ 30 ደቂቃ KAND 11 ህክምና በኋላ ብዙም እንዳልጨመረ ያሳያል። በ 50 μM ወይም 100 μM KAND ከ90 ደቂቃ ህክምና በኋላ የሞቱ ሴሎች ቁጥር ወደ 43.7% ወይም 80.1% አድጓል (ምስል 7c)።እነዚህ መረጃዎች ሲደመር፣ ልብ ወለድ ursolic acid derivative KAND 11 ቀደም ሲል የማይታወቅ የእርምጃ ዘዴ ያለው በእጽዋት-ተኮር የሳይቶስክሌትታል መከላከያ ዘዴ መሆኑን ያመለክታሉ።
KAND ኮርቲካል ማይክሮቱቡሎች፣ የአክቲን ፋይበር እና የትምባሆ BY-2 ሕዋሳት አዋጭነት ላይ ተጽእኖ ያደርጋል።(ሀ) TagRFP-TUA6 ባሉበት በ BY-2 ሴሎች ውስጥ የሚገኙትን ኮርቲካል ማይክሮቱቡልሶችን ማየት።BY-2 ሕዋሳት በ KAND 11 (50 μM ወይም 100 μM) ወይም DMSO በኮንፎካል ማይክሮስኮፒ ተመርምረዋል።Cortical microtubule density ከ25 ገለልተኛ ህዋሶች ማይክሮግራፍ ተሰላ።ደብዳቤዎች ጉልህ ልዩነቶችን ያመለክታሉ (የቱኪ HSD ሙከራ ፣ ገጽ<0.05)የመጠን አሞሌ = 10 µm(ለ) በ GFP-ABD2 ፊት በሚታየው በ BY-2 ሕዋሳት ውስጥ ያሉ ኮርቲካል አክቲን ክሮች።BY-2 ሕዋሳት በ KAND 11 (50 μM ወይም 100 μM) ወይም DMSO በኮንፎካል ማይክሮስኮፒ ተመርምረዋል።የኮርቲካል አክቲን ክሮች ጥግግት ከ25 ገለልተኛ ሴሎች ማይክሮግራፍ ይሰላል።ደብዳቤዎች ጉልህ ልዩነቶችን ያመለክታሉ (የቱኪ HSD ሙከራ ፣ ገጽ<0.05)የመጠን አሞሌ = 10 µm(ሐ) የሞቱ BY-2 ሕዋሳት በኢቫንስ ሰማያዊ ቀለም መመልከት።BY-2 ህዋሶች በ KAND 11 (50 μM ወይም 100 μM) ወይም DMSO የታከሙ በብሩህ የመስክ ማይክሮስኮፒ ተመርምረዋል።n=3.የመጠን አሞሌ = 100 μm
አዳዲስ የተፈጥሮ ምርቶች መገኘት እና መተግበር በሰው ልጅ ህይወት ውስጥ በህክምና እና በግብርና ላይ ከፍተኛ እድገት አስገኝቷል.ከተፈጥሮ ሀብቶች ጠቃሚ የሆኑ ውህዶችን ለማግኘት ታሪካዊ ምርምር ተካሂዷል.በተለይም actinomycetes እንደ አንቲፓራሲቲክ አንቲባዮቲኮች ለኔማቶዶች ጠቃሚ እንደሆኑ ይታወቃሉ ምክንያቱም የተለያዩ ሁለተኛ ደረጃ ሜታቦላይቶችን እንደ አቬርሜክቲን ፣የአይቨርሜክቲን እና ብሉሚሲን የእርሳስ ውህድ እና ተዋጽኦዎች በመድኃኒትነት እንደ ፀረ-ካንሰር ወኪል21,22 ጥቅም ላይ ይውላሉ።በተመሳሳይ ከአክቲኖሚሴቴስ የተለያዩ ፀረ-አረም ውህዶች የተገኙ ሲሆን አንዳንዶቹም ቀድሞ ለንግድ ጥቅም ላይ ይውላሉ1,23.ስለዚህ የተፈጥሮ ምርቶችን በተፈለገው ባዮሎጂያዊ እንቅስቃሴዎች ለመለየት የአክቲኖሚሴቴ ሜታቦላይትስ ትንተና እንደ ውጤታማ ስልት ይቆጠራል.በዚህ ጥናት፣ ከኤስ ዌራንሲስ አዲስ ውህድ coumamonamide አግኝተናል እና በተሳካ ሁኔታ አዋህደነዋል።Ursonic አሲድ የ urbenamide እና ተዋጽኦዎቹ ሰው ሰራሽ መካከለኛ ነው።የባህሪ ስር ከርሊንግ ሊያስከትል፣ ከመካከለኛ እስከ ጠንካራ የአረም ማጥፊያ እንቅስቃሴን ያሳያል፣ እና የእጽዋት ማይክሮቱቡሎችን በቀጥታም ሆነ በተዘዋዋሪ ሊጎዳ ይችላል።ነገር ግን የኡርሞቶኒክ አሲድ አሠራር አሁን ካሉት የማይክሮቱቡል አጋቾቹ ሊለይ ይችላል፣ ምክንያቱም KAND 11 በተጨማሪም የአክቲን ፋይበርን ስለሚረብሽ እና የሕዋስ ሞትን ስለሚያስከትል urmotonic acid እና ተዋጽኦዎቹ በተለያዩ የሳይቶስክሌትታል አወቃቀሮች ላይ ተጽዕኖ የሚያሳድሩበትን የቁጥጥር ዘዴ ይጠቁማል።.
የ urbenonic አሲድ ተጨማሪ ዝርዝር ባህሪ የ urbenonic አሲድ አሠራር ዘዴን በተሻለ ለመረዳት ይረዳል.በተለይም የሚቀጥለው ግብ የኡርሶኒክ አሲድ ከተቀነሰ ማይክሮቱቡል ጋር የመተሳሰር ችሎታን መገምገም ሲሆን ursonic acid እና ውጤቶቹ በቀጥታ በማይክሮ ቱቡሎች ላይ እንደሚሰሩ እና እነሱን ዲፖሊሜራይዝድ ማድረግ ወይም ድርጊታቸው ማይክሮቱቡል መረጋጋትን ያስከትላል።በተጨማሪም ማይክሮቱቡሎች ቀጥተኛ ዒላማ በማይሆኑበት ጊዜ በእጽዋት ሴሎች ላይ የዩርሶኒክ አሲድ ድርጊት የሚፈጸምበትን ቦታ እና ሞለኪውላዊ ኢላማዎችን መለየት የተዛማጅ ውህዶችን ባህሪያት እና የአረም ማጥፊያ እንቅስቃሴን ለማሻሻል የሚረዱ መንገዶችን የበለጠ ለመረዳት ይረዳል።የእኛ የባዮአክቲቭ ዳሰሳ የዩርሶኒክ አሲድ እንደ አረብቢዶፕሲስ ታሊያና፣ ትምባሆ እና ሊቨርዎርት ባሉ እፅዋት እድገት ላይ ያለውን ልዩ ሳይቶቶክሲክ ችሎታ አሳይቷል፣ ኢ. ኮላይም ሆነ ሄላ ሴሎች አልተጎዱም።ለእንስሳት ህዋሶች ትንሽ ወይም ምንም አይነት መርዛማነት የኡርሶኒክ አሲድ ተዋጽኦዎች ጥቅም ላይ የሚውሉት በክፍት የእርሻ ማሳዎች ውስጥ ጥቅም ላይ የሚውሉ ፀረ አረም ኬሚካሎች ሆነው ከተፈጠሩ ነው።በእርግጥም ማይክሮቱቡሎች በ eukaryotes ውስጥ የተለመዱ መዋቅሮች በመሆናቸው በእጽዋት ውስጥ የመረጡት መከልከል ለፀረ-ተባይ መድሃኒቶች ቁልፍ መስፈርት ነው.ለምሳሌ፣ propyzamide፣ ከቱቡሊን ጋር በቀጥታ የሚገናኝ እና ፖሊሜራይዜሽንን የሚከለክለው የማይክሮቱቡል ዲፖሊሜራይዝድ ወኪል፣ ለእንስሳት ሴሎች 24 ባለው ዝቅተኛ መርዛማነት የተነሳ እንደ አረም ማከሚያነት ያገለግላል።ከዲስኦፒራሚድ በተቃራኒ፣ ተዛማጅ ቤንዛሚዶች የተለያዩ የዒላማ ዝርዝሮች አሏቸው።ከእጽዋት ማይክሮቱቡል በተጨማሪ RH-4032 ወይም benzoxamide በተጨማሪም የእንስሳት ሴሎችን ወይም oomycetes ማይክሮቱቡሎችን ይከለክላል, እና ዛሊላሚድ በአነስተኛ phytotoxicity25,26,27 ምክንያት እንደ ፈንገስነት ጥቅም ላይ ይውላል.አዲስ የተገኘው ድብ እና ተዋጽኦዎቹ በእጽዋት ላይ የተመረጠ ሳይቶቶክሲክነትን ያሳያሉ፣ ነገር ግን ተጨማሪ ማሻሻያዎች የዒላማቸውን ልዩነት ሊቀይሩ እንደሚችሉ እና በሽታ አምጪ ፈንገሶችን ወይም oomycetesን ለመቆጣጠር ተጨማሪ ተዋጽኦዎችን ሊሰጡ እንደሚችሉ ልብ ሊባል ይገባል።
የኡርቤኖኒክ አሲድ ልዩ ባህሪያት እና ተዋጽኦዎቹ ለዕድገታቸው እንደ አረም ኬሚካል እና እንደ የምርምር መሳሪያዎች ጥቅም ላይ ይውላሉ.የእጽዋትን ሕዋስ ቅርፅ ለመቆጣጠር የሳይቶስኮሌቶን አስፈላጊነት በሰፊው ይታወቃል.ቀደምት ጥናቶች እንደሚያሳዩት ተክሎች ሞርሞጅንን በትክክል ለመቆጣጠር ማይክሮቱቡል ተለዋዋጭዎችን በመቆጣጠር የኮርቲካል ማይክሮቱቡል አደረጃጀት ውስብስብ ዘዴዎችን እንደፈጠሩ አረጋግጠዋል.የማይክሮ ቲዩቡል እንቅስቃሴን ለመቆጣጠር ኃላፊነት ያላቸው ከፍተኛ ቁጥር ያላቸው ሞለኪውሎች ተለይተዋል፣ እና ተዛማጅ ጥናቶች አሁንም በመካሄድ ላይ ናቸው3,4,28.በእጽዋት ሴሎች ውስጥ ስለ ማይክሮቱቡል ተለዋዋጭነት አሁን ያለን ግንዛቤ የኮርቲካል ማይክሮቱቡል አደረጃጀት ዘዴዎችን ሙሉ በሙሉ አያብራራም።ለምሳሌ, ሁለቱም ዳይሶፒራሚድ እና ኦሪዛሊን ማይክሮቱቡሎችን ከፖሊሜራይዝድ ቢያደርጉም, ዳይሶፒራሚድ ከፍተኛ የስር መዛባትን ያስከትላል, ኦሪዛሊን በአንጻራዊ ሁኔታ መጠነኛ ተጽእኖ አለው.ከዚህም በላይ ማይክሮቱቡሎችን የሚያረጋጋው በቱቡሊን ውስጥ ያለው ሚውቴሽን ሥሩ ውስጥ dextrorotation እንዲፈጠር ያደርጋል፣ ፓክሊታክስል ደግሞ የማይክሮቱቡል ተለዋዋጭነትን የሚያረጋጋ አይደለም።ስለዚህ የኡርሶሊክ አሲድ ሞለኪውላዊ ኢላማዎችን በማጥናት መለየት በእጽዋት ኮርቲካል ማይክሮቱቡሎች ቁጥጥር ላይ አዳዲስ ግንዛቤዎችን መስጠት ይኖርበታል።ልክ እንደ ዳይሶፒራሚድ እና ብዙም ውጤታማ ያልሆኑ እንደ ኦሪዛሊን ወይም ኩማሞቶሪክ አሲድ ያሉ ኬሚካሎችን ወደፊት ማወዳደር የተዛባ እድገት እንዴት እንደሚከሰት ፍንጭ ይሰጣል።
በሌላ በኩል፣ ከመከላከያ ጋር የተያያዙ የሳይቶስክሌትታል ማስተካከያዎች የኡርሶኒክ አሲድ ሳይቲቶክሲክሽን ለማብራራት ሌላ አማራጭ ናቸው።በሽታ አምጪ ተህዋሲያን መበከል ወይም ኤሊሲተርን ወደ እፅዋት ሕዋሳት ማስተዋወቅ አንዳንድ ጊዜ የሳይቶስክሌትስ መጥፋት እና የሚቀጥለው የሕዋስ ሞት29 ያስከትላል።ለምሳሌ፣ Oomycete-derived cryptoxanthin ከትንባሆ ሕዋስ ሞት በፊት ማይክሮቱቡልስ እና አክቲን ፋይበርን እንደሚያስተጓጉል ተዘግቧል፣ ይህም በ KAND ህክምና30,31 እንደሚከሰት አይነት።በመከላከያ ምላሾች እና በኡርሶኒክ አሲድ የተነሳሱ ሴሉላር ምላሾች መካከል ያለው ተመሳሳይነት የጋራ ሴሉላር ሂደቶችን ያስነሳሉ ብለን እንድንገምት አድርጎናል፣ ምንም እንኳን የኡርሶኒክ አሲድ ከ cryptoxanthin የበለጠ ፈጣን እና ጠንካራ ውጤት ቢታይም።ይሁን እንጂ ጥናቶች እንደሚያሳዩት የአክቲን ፋይበር መቋረጥ ድንገተኛ የሕዋስ ሞትን ያበረታታል, ይህም ሁልጊዜ በማይክሮቱቡል መቋረጥ29 አይደለም.በተጨማሪም ፣ የኡርሶኒክ አሲድ ተዋጽኦዎች እንደሚያደርጉት በሽታ አምጪ ተህዋሲያን ወይም ኤሊሲተር የተዛባ ሥር እድገትን ያመጣ እንደሆነ መታየት አለበት።ስለዚህ, የሞለኪውላር እውቀት የመከላከያ ምላሾችን እና የሳይቶስስክሌትስን የሚያገናኝ ማራኪ ችግር ነው.ከኡርሶኒክ አሲድ ጋር የተያያዙ ዝቅተኛ ሞለኪውላዊ ክብደት ውህዶች፣ እንዲሁም የተለያየ አቅም ያላቸውን የተለያዩ ተዋጽኦዎች በመጠቀም ያልታወቁ ሴሉላር ስልቶችን ኢላማ ለማድረግ እድሎችን ሊሰጡ ይችላሉ።
አንድ ላይ ሲደመር፣ የማይክሮቱቡል ተለዋዋጭነትን የሚቀይሩ አዳዲስ ውህዶችን ማግኘት እና መተግበሩ በእጽዋት ሕዋስ ቅርጽ ላይ ያለውን ውስብስብ ሞለኪውላዊ ዘዴዎችን ለመፍታት ኃይለኛ ዘዴዎችን ይሰጣል።በዚህ ዐውደ-ጽሑፍ, በቅርብ ጊዜ የተገነባው ውሁድ urmotonic acid, ማይክሮቱቡል እና አክቲን ክሮች ላይ ተጽእኖ የሚያሳድር እና የሕዋስ ሞትን የሚያነሳሳ, በማይክሮቱቡል ቁጥጥር እና በእነዚህ ሌሎች ዘዴዎች መካከል ያለውን ግንኙነት ለመለየት እድል ይሰጣል.ስለዚህ ዩርበኖኒክ አሲድ በመጠቀም ኬሚካላዊ እና ባዮሎጂካል ትንተና ተክሉን ሳይቶስክሌትቶን የሚቆጣጠሩትን ሞለኪውላዊ ቁጥጥር ዘዴዎችን ለመረዳት ይረዳናል.
S. werraensis MK493-CF1ን ወደ 500 ሚሊ ግራ የተጋገረ የኤርለንሜየር ብልቃጥ ውስጥ 110 ሚሊ ሊት የዘር መካከለኛ 2% (ወ/ቪ) ጋላክቶስ ፣ 2% (ወ/ቪ) የኢሴስ ፓስታ ፣ 1% ( w/v) Bacto ጥንቅርን ያካትታል። .-ሶይቶን (ቴርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ, ኢንክ.), 0.5% (ወ / ቪ) የበቆሎ ማውጣት (KOGOSTCH Co., Ltd., ጃፓን), 0.2% (w / v) (NH4) 2SO4 እና 0.2% CaCO3 በተቀላቀለ ውሃ ውስጥ.(pH 7.4 ከማምከን በፊት).የዘር ባህሎች በ rotary shaker (180 rpm) በ 27 ° ሴ ለ 2 ቀናት ውስጥ ተተክለዋል.በጠንካራ ሁኔታ መፍላት በኩል ማምረት።የዘር ባህሉ (7 ሚሊ ሊትር) ወደ 500 ሚሊ ኪ-1 ጠርሙስ 40 ግራም የምርት ማእከላዊ 15 ግራም የታጨገ ገብስ (MUSO Co., Ltd., ጃፓን) እና 25 ግራም የተቀላቀለ ውሃ (pH አልተስተካከለም) ያካትታል. ከማምከን በፊት) .).ለ 14 ቀናት በጨለማ ውስጥ በ 30 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ መፍላት ተከናውኗል.የማፍላቱ ቁሳቁስ በ 40 ml / ጠርሙስ EtOH እና በሴንትሪፉድ (1500 ግ, 4 ° ሴ, 10 ደቂቃ) ወጥቷል.የባህል ሱፐርናታንት (60 ሚሊ ሊትር) በ10% MeOH/EtOAc ድብልቅ ወጥቷል።የኦርጋኒክ ሽፋን ቅሪት (59.5 mg) ለማግኘት በተቀነሰ ግፊት ተነነ፣ ይህም በHPLC በ gradient elution (0-10 ደቂቃ፡ 90%) በግልባጭ ዙር አምድ (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120፣ 5 μm፣ ID) 10 ሚሜ × ርዝመት 250 ሚሜ) H2O/CH3CN፣ 10–35 ደቂቃዎች፡ 90% H2O/CH3CN እስከ 70% H2O/CH3CN (ግራዲንት)፣ 35–45 ደቂቃ፡ 90% H2O/EtOH፣ 45–155 ደቂቃዎች፡ 90% H2O / EtOH ወደ 100% EtOH (ግራዲየንት (ግራዲየንት), 155-200 ደቂቃ: 100% EtOH) በ 1.5 ml / ደቂቃ ፍሰት መጠን, coumamonamide (1, 36.0 mg) እንደ ነጭ የአሞርፊክ ዱቄት ተለይቷል.
ኩማሞቶአሚድ (1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (ሰ, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ የተሰላው እሴት፡ 141.0659፣ የሚለካው እሴት፡ 141.0663፣ IR νmax 3451፣ 3414፣ 3173፣ 2938፣ 1603፣ 15973፣ 15.3 ሴሜ
የኮሎምቢያ ዘሮች (ኮል-0) ከአረብኛ ባዮሎጂካል ሪሶርስ ሴንተር (ABRC) የተገኙት ለምርምር አገልግሎት ፈቃድ ነው።የ Col-0 ዘሮች በእኛ የላቦራቶሪ ሁኔታ ውስጥ ተባዝተው ተጠብቀው ነበር እና እንደ ዱር-አረብኛ ተክሎች ጥቅም ላይ ውለዋል.የአረቢዶፕሲስ ዘሮች በገጽታ ማምከን እና በግማሽ ጥንካሬ ሙራሺጌ እና ስኮግ መካከለኛ 2% ሱክሮስ (ፉጂፊልም ዋኮ ንፁህ ኬሚካል)፣ 0.05% (ወ/ቪ) 2-(4-ሞሮፎሊኖ) ኤታኔሰልፎኒክ አሲድ (ኤምኢኤስ) (ፉጂፊልም ዋኮ ንፁህ ኬሚካል) ተሠርተዋል። ).) እና 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, በ 23 ° ሴ እና ቋሚ ብርሃን.የ phs1-1 ሚውታንት ዘሮች በቲ.ሃሺሞቶ (ናራ የሳይንስ እና ቴክኖሎጂ ተቋም) ተሰጥተዋል።
የዝርያ ዘር SR-1 በቲ.ሃሺሞቶ (ናራ የሳይንስ እና ቴክኖሎጂ ተቋም) ተሰጥቷቸዋል እና እንደ የዱር ትምባሆ ተክሎች ጥቅም ላይ ይውላሉ.የትምባሆ ዘሮች እንዲበቅሉ ለማበረታታት በንፁህ ውሃ ውስጥ ለሶስት ምሽቶች በማምከን እና በንፁህ ውሃ ውስጥ ይንከሩ ፣ ከዚያም በግማሽ ጥንካሬ ውስጥ 2% sucrose ፣ 0.05% (w/v) MES እና 0.8% ጄላን ሙጫ (ፉጂፊልም ዋኮ ንጹህ ኬሚካል) ይይዛሉ። ሙራሺጌ።እና Skoog መካከለኛ) ከ pH 5.7 ጋር እና በ 23 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ውስጥ በቋሚ ብርሃን ውስጥ ተተክሏል.
Strain Tak-1 የቀረበው በቲ ኮህቺ (ኪዮቶ ዩኒቨርሲቲ) ሲሆን ለ liverwort ጥናት እንደ መደበኛ የሙከራ ክፍል ጥቅም ላይ ውሏል።ጌማ ከተመረቱ ተክሎች የተገኘ ሲሆን ከዚያም በጋምበርግ B5 መካከለኛ (ፉጂፊልም ዋኮ ንፁህ ኬሚካል) ላይ 1% ሱክሮስ እና 0.3% ጄላን ሙጫ በያዙት እና በ 23 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ በተከታታይ ብርሃን ተተክሏል።
ትምባሆ BY-2 ህዋሶች (Nicotiana tabacum L. cv. Bright ቢጫ 2) የቀረበው በኤስ ሃሴዛዋ (የቶኪዮ ዩኒቨርሲቲ) ነው።BY-2 ሴሎች በተሻሻለው ሊንሴሜየር እና ስኮግ መካከለኛ 95-እጥፍ እና በየሳምንቱ በ 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 32 ተጨምረዋል.የሕዋስ እገዳው በጨለማ በ 27 ዲግሪ ሴንቲግሬድ በ 130 ሩብ ደቂቃ በ rotary shaker ላይ ተቀላቅሏል.ትኩስ መካከለኛ መጠን በ 10 እጥፍ መጠን ያላቸውን ሴሎች ያጠቡ እና በተመሳሳይ መካከለኛ እንደገና ይንጠለጠሉ።BY-2 ትራንስጀኒክ ሴል መስመሮች የማይክሮቱቡል ማርከር TagRFP-TUA6 ወይም Actin filament ማርከር GFP-ABD2 በአበባው ሞዛይክ ቫይረስ 35S አራማጅ ስር እንደተገለጸው 33,34,35 ተፈጥረዋል።እነዚህ የሕዋስ መስመሮች ለዋናው የ BY-2 ሕዋስ መስመር ጥቅም ላይ ከዋሉት ጋር ተመሳሳይ ሂደቶችን በመጠቀም ሊቆዩ እና ሊመሳሰሉ ይችላሉ።
የሄላ ሴሎች በዱልቤኮ የተቀየረ ኢግል መካከለኛ (ዲኤምኤም) (ላይፍ ቴክኖሎጂዎች) በ10% fetal bovine serum፣ 1.2 U/ml penicillin እና 1.2 μg/ml streptomycin በ 37°C ኢንኩቤተር ከ 5% CO2 ጋር ተጨምረዋል።
በዚህ የእጅ ጽሑፍ ውስጥ የተገለጹት ሁሉም ሙከራዎች የተከናወኑት በጃፓን የባዮሴፍቲ ደንቦች እና መመሪያዎች መሰረት ነው።
ውህዶች በዲሜትል ሰልፎክሳይድ (ዲኤምኤስኦ፣ ፉጂፊልም ዋኮ ንጹህ ኬሚካል) እንደ አክሲዮን መፍትሄዎች ተፈትተው በኤምኤስ መካከለኛ ለአረብኛ እና ትንባሆ ወይም በጋምበርግ B5 መካከለኛ ለ liverwort ተፈጭተዋል።ለሥሩ እድገት መከልከል በአንድ ሳህን ከ10 በላይ ዘሮች የተጠቆሙትን ውህዶች ወይም DMSO በያዙ በአጋር መካከለኛ ላይ ተዘርተዋል።ዘሮች ለ 7 ቀናት በእድገት ክፍል ውስጥ ተተክለዋል.ችግኞቹ ፎቶግራፍ ተነስተው ሥሮቹ ርዝመት ተለካ.ለአረቢዶፕሲስ ማብቀል ምርመራ፣ 200 μM ውህድ ወይም ዲኤምኤስኦ በያዘ በአጋር መካከለኛ 48 ዘሮች በአንድ ሳህን ላይ ተዘሩ።የአረብኛ ዘሮች በእድገት ክፍል ውስጥ ይበቅላሉ እና የበቀለ ቡቃያዎች ቁጥር ከተበቀለ ከ 7 ቀናት በኋላ ተቆጥሯል (ዳግ).ለትንባሆ ማብቀል ምርመራ፣ 24 ዘሮች በአንድ ሳህን 200 μM KAND ወይም DMSO በያዙ በአጋር መካከለኛ ላይ ተዘሩ።የትምባሆ ዘሮች በእድገት ክፍል ውስጥ ይበቅላሉ እና የበቀለ ችግኞች ቁጥር ከ 14 ቀናት በኋላ ተቆጥሯል.ለLiverwort እድገት መከልከል ከእያንዳንዱ ሳህን 9 ሽሎች በአጋር መካከለኛ ላይ ተለጥፈው የተጠቆሙትን የ KAND ወይም DMSO መጠን በያዙ እና በእድገት ክፍል ውስጥ ለ14 ቀናት ተክለዋል።
የስር ሜሪስቴም ድርጅትን ለማየት በ5 mg/ml propidium iodide (PI) የተበከሉ ችግኞችን ይጠቀሙ።የ PI ምልክቶች በ TCS SPE confocal laser scanning ማይክሮስኮፕ (Leica Microsystems) በመጠቀም በፍሎረሰንስ ማይክሮስኮፒ ታይተዋል።
በ β-glucuronidase (GUUS) ስሮች ላይ ሂስቶኬሚካላዊ ቀለም የተካሄደው በማላሚ እና ቤንፊ36 በተገለጸው ፕሮቶኮል መሰረት ነው።ችግኞች በአንድ ምሽት በ 90% acetone ውስጥ ተስተካክለዋል, በ 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid በ GUS ቋት ውስጥ ለ 1 ሰዓት ያህል በቆሸሸ እና በሃይድሪድ ክሎራልዲዳይድ መፍትሄ ውስጥ ይቀመጣሉ.(8 g ክሎራል ሃይድሬት፣ 2 ሚሊር ውሃ እና 1 ሚሊር ግሊሰሮል) እና በ Axio Imager M1 ማይክሮስኮፕ (ካርል ዜይስ) በመጠቀም በልዩ ጣልቃገብነት ንፅፅር ማይክሮስኮፕ ይስተዋላል።
የስር ማዕዘኖች የሚለካው በ 7 ቀን ዕድሜ ላይ ባሉ ችግኞች ላይ በአቀባዊ በተቀመጡ ሳህኖች ላይ ነው።በደረጃ 6 ላይ እንደተገለጸው የሥሩን አንግል ከስበት ቬክተር አቅጣጫ ይለኩ።
በፕሮቶኮል 37 ላይ ጥቃቅን ማሻሻያዎችን በማድረግ የኮርቲካል ማይክሮቱቡሎች ዝግጅት እንደተገለጸው ተስተውሏል.ፀረ-β-ቱቡሊን ፀረ እንግዳ አካላት (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) እና Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) በ 1:1000 እና 1:100 dilutions ላይ እንደ ዋና እና ሁለተኛ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካላት ጥቅም ላይ ውለዋል። በቅደም ተከተል.የፍሎረሰንት ምስሎች በ TCS SPE confocal laser scanning ማይክሮስኮፕ (Leica Microsystems) በመጠቀም የተገኙ ናቸው።የZ-stack ምስሎችን ያግኙ እና በአምራቹ መመሪያ መሰረት ከፍተኛውን የጥንካሬ ትንበያ ይፍጠሩ።
በአምራቹ መመሪያ መሰረት የሄላ ሴል ፕሮላይዜሽን ምርመራ የተደረገው የሕዋስ ቆጠራ ኪት 8 (ዶጂንዶ) በመጠቀም ነው።
የE.coli DH5α እድገት በባህል ውስጥ ያለውን የሴል እፍጋት በመለካት በ600 nm (OD600) ስፔክትሮፖቶሜትር በመጠቀም ተንትኗል።
በትራንስጀኒክ BY-2 ሴሎች ውስጥ የሳይቶስክሌትታል ድርጅት በ CSU-X1 ኮንፎካል መቃኛ መሳሪያ (ዮኮጋዋ) እና በ sCMOS ካሜራ (ዚላ፣ አንዶር ቴክኖሎጂ) የተገጠመ የፍሎረሰንስ ማይክሮስኮፕ በመጠቀም ታይቷል።የሳይቶስክሌትታል ጥግግት በምስል ትንተና የተገመገመ ሲሆን ይህም የሳይቶስክሌትታል ፒክሰሎች በመቶኛ ከሳይቶፕላስሚክ ፒክስሎች ጋር በተያያዙ ምስሎች ImageJ ሶፍትዌርን በመጠቀም እንደተገለጸው ቆጥሯል38,39።
በ BY-2 ሴሎች ውስጥ የሕዋስ መሞትን ለማወቅ፣ የሕዋስ እገዳው የተወሰነ ክፍል በ 0.05% ኢቫንስ ሰማያዊ ለ 10 ደቂቃዎች በክፍል ሙቀት ውስጥ ተተክሏል።የተመረጡ ኢቫንስ ሰማያዊ የሞቱ ሴሎች ቀለም በተነካው የፕላዝማ ማሽነሪ40 ከዋጋ ህዋሶች በሚወጣው ቀለም ላይ ይመረኮዛል።በደማቅ መስክ ማይክሮስኮፕ (BX53, ኦሊምፐስ) በመጠቀም ቀለም ያላቸው ሴሎች ተስተውለዋል.
የሄላ ሴሎች በ DMEM ውስጥ በ 10% FBS ተጨምረዋል እርጥበት በተሞላ ኢንኩቤተር በ 37 ° ሴ እና 5% CO2.ሴሎች በ 100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (ጊብኮ) ወይም 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) ለ 6 ሰዓታት በ 37 ° ሴ.ሴሎች በ MetOH ለ 10 ደቂቃዎች እና ከዚያም በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 5 ደቂቃዎች በአሲቴት ተስተካክለዋል.ቋሚ ሴሎች በ β-tubulin ቀዳማዊ ፀረ እንግዳ አካላት (1D4A4, Proteintech: 66240-1) በ 0.5% BSA/PBS ውስጥ ለ 2 ሰአታት ተዳፍረዋል, 3 ጊዜ በ TBST ታጥበው, ከዚያም በ Alexa Fluor የፍየል ፀረ እንግዳ አካላት ተካተዋል.488 1 ሰዓት.- Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) እና 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) በ 0.5% BSA/PBS ተበርዟል።በ TBST ሶስት ጊዜ ከታጠበ በኋላ በኒኮን ግርዶሽ ቲ-ኢ በተገለበጠ ማይክሮስኮፕ ላይ የቆሸሹ ሴሎች ታይተዋል።ምስሎች የተያዙት ከቀዘቀዘ Hamamatsu ORCA-R2 CCD ካሜራ MetaMorph ሶፍትዌር (ሞለኪውላር መሳሪያዎች) በመጠቀም ነው።