የኡርሳ ሞኖአሚዶችን እንደ አዲስ የእፅዋት እድገት አጋቾች ግኝት፣ ባህሪ እና ተግባራዊ መሻሻል የእፅዋት ማይክሮቱቡሎችን የሚነኩ ናቸው።

Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን። የሚጠቀሙበት የአሳሽ ስሪት የተወሰነ የCSS ድጋፍ አለው። ለተሻለ ውጤት፣ የአሳሽዎን አዲስ ስሪት እንዲጠቀሙ እንመክራለን (ወይም በኢንተርኔት ኤክስፕሎረር ውስጥ የተኳኋኝነት ሁነታን ያሰናክሉ)። ይህ በእንዲህ እንዳለ፣ ቀጣይነት ያለው ድጋፍ ለማረጋገጥ፣ ጣቢያውን ያለ ቅጥ ወይም ጃቫስክሪፕት እያሳየን ነው።
የተፈጥሮ ምርቶችን ማግኘትና ጠቃሚ አጠቃቀም የሰውን ሕይወት ለማሻሻል ሊረዳ ይችላል። የእፅዋት እድገትን የሚከላከሉ ኬሚካሎች አረሞችን ለመቆጣጠር እንደ አረም ማጥፊያ በሰፊው ጥቅም ላይ ይውላሉ። የተለያዩ የአረም ማጥፊያ ዓይነቶችን መጠቀም ስለሚያስፈልግ፣ አዳዲስ የአሠራር ዘዴዎችን በመጠቀም ውህዶችን መለየት ያስፈልጋል። በዚህ ጥናት፣ ከስትሬፕቶማይሲስ ዌርራንሲስ MK493-CF1 የተገኘ አዲስ N-alkoxypyrrole ውህድ፣ coumamonamide፣ አግኝተን ሙሉውን የማዋሃድ ሂደት መርምረናል። በባዮሎጂካል እንቅስቃሴ ምርመራዎች፣ ኡርስ-ሞኖአሚክ አሲድ የኡርስ-ሞኖአሚድ ሰው ሰራሽ መካከለኛ እና እምቅ አቅም መሆኑን ደርሰንበታል።የእፅዋት እድገት ተከላካይበተጨማሪም፣ የሄላ ሴሎችን እድገት ላይ አሉታዊ ተጽዕኖ ሳያሳድር ከፍተኛ የእፅዋት ማጥፊያ እንቅስቃሴ ያለው የኡርቤኖኒክ አሲድ ተዋጽኦዎችን (UDA) ጨምሮ የተለያዩ የኡርቤኖኒክ አሲድ ተዋጽኦዎችን አዘጋጅተናል። በተጨማሪም የኡርሞቶኒክ አሲድ ተዋጽኦዎች የእፅዋት ማይክሮቱቡሎችን እንደሚያበላሹ ደርሰንበታል፤ በተጨማሪም፣ KAND የአክቲን ክሮች ላይ ተጽዕኖ ያሳድራል እና የሕዋስ ሞትን ያስከትላል፤ እነዚህ ባለብዙ ገፅታ ውጤቶች ከሚታወቁት የማይክሮቱቡል አጋቾች የተለዩ ሲሆኑ ለኡርሶኒክ አሲድ አዲስ የተግባር ዘዴን ይጠቁማሉ፣ ይህም በአዳዲስ የአረም ማጥፊያዎች ልማት ውስጥ ጠቃሚ ጥቅምን ይወክላል።
ጠቃሚ የተፈጥሮ ምርቶችን እና ተዋጽኦዎቻቸውን ማግኘት እና ተግባራዊ አተገባበር የሰውን ሕይወት ጥራት ለማሻሻል መንገድ ነው። በማይክሮባዮኖች፣ በእፅዋት እና በነፍሳት የሚመረቱ ሁለተኛ ደረጃ ሜታቦላይቶች በሕክምና እና በግብርና ውስጥ ከፍተኛ እድገት አስገኝተዋል። ብዙ አንቲባዮቲኮች እና ፀረ-ሉኪሚያ መድኃኒቶች ከተፈጥሯዊ ምርቶች ተዘጋጅተዋል። በተጨማሪም፣ የተለያዩ ዓይነቶችፀረ-ተባይ መድኃኒቶችፈንገስ ማጥፊያዎች እና ፀረ-አረም መድኃኒቶች ከእነዚህ ተፈጥሯዊ ምርቶች ለግብርና ጥቅም ላይ ይውላሉ። በተለይም የአረም መቆጣጠሪያ ፀረ-አረም መድኃኒቶች በዘመናዊ ግብርና ውስጥ የሰብል ምርትን ለመጨመር አስፈላጊ መሣሪያዎች ናቸው፣ እና የተለያዩ አይነት ውህዶች ቀድሞውኑ ለንግድ ጥቅም ላይ ይውላሉ። እንደ ፎቶሲንተሲስ፣ የአሚኖ አሲድ ሜታቦሊዝም፣ የሴል ግድግዳ ውህደት፣ ሚቶሲስን መቆጣጠር፣ የፊቶሆርሞን ምልክት ማድረጊያ ወይም የፕሮቲን ውህደት ያሉ በእፅዋት ውስጥ ያሉ በርካታ የሴል ሂደቶች የአረም ማጥፊያዎች የተለመዱ ኢላማዎች እንደሆኑ ይቆጠራሉ። የማይክሮቱቡል ተግባርን የሚገቱ ውህዶች የሚቶቲክ ቁጥጥርን በመነካካት የእፅዋትን እድገት የሚነኩ የተለመዱ የአረም ማጥፊያዎች ክፍል ናቸው።
ማይክሮቱቡሎች የሳይቶስክሌተን ክፍሎች ሲሆኑ በዩካርዮቲክ ሴሎች ውስጥ በስፋት ይጠበቃሉ። ቱቡሊን ሄቴሮዲመር α-ቱቡሊን እና β-ቱቡሊን የሚባሉትን ቀጥ ያሉ ማይክሮቱቡል ፕሮቶፊላመንቶችን የሚፈጥሩ ሲሆን 13 ፕሮቶፊላመንቶች ሲሊንደራዊ መዋቅር ይፈጥራሉ። ማይክሮቱቡሎች በእፅዋት ሴሎች ውስጥ በርካታ ሚናዎችን ይጫወታሉ፣ ይህም የሴል ቅርፅን፣ የሴል ክፍፍልን እና የውስጥ አካላትን ትራንስፖርትን ጨምሮ3,4። የእፅዋት ሴሎች ከኢንተርፌዝ ፕላዝማ ሽፋን በታች ማይክሮቱቡሎችን ይይዛሉ፣ እና እነዚህ ኮርቲካል ማይክሮቱቡሎች የሚባሉት በሴሉሎስ ሲንቴዝ ውህዶች ቁጥጥር አማካኝነት የሴሉሎስ ማይክሮፋይብሪሎችን አደረጃጀት እንደሚቆጣጠሩ ይታሰባል። የስር ጫፉ በፍጥነት በሚራዘምበት ዞን ውስጥ የሚገኙት የስር ኤፒደርማል ሴሎች ኮርቲካል ማይክሮቱቡሎች በጎን በኩል ይገኛሉ፣ እና ሴሉሎስ ማይክሮፋይበሮች እነዚህን ማይክሮቱቡሎች ተከትለው የሴል መስፋፋት አቅጣጫን ይገድባሉ፣ በዚህም የአኒሶትሮፒክ ሴል ማራዘምን ያበረታታሉ። ስለዚህ የማይክሮቱቡል ተግባር ከእፅዋት ሞርፎሎጂ ጋር በቅርበት የተቆራኘ ነው። ቱቡሊንን በሚገልጹ ጂኖች ውስጥ የሚገኙ የአሚኖ አሲድ ምትክዎች የኮርቲካል ማይክሮቱቡል ድርድሮችን እና በአረብቢዶፕሲስ 6,7 ውስጥ የግራ ወይም የቀኝ ጎን እድገትን ያስከትላሉ። በተመሳሳይ፣ የማይክሮቱቡል ተለዋዋጭነትን የሚቆጣጠሩ በማይክሮቱቡል ጋር በተያያዙ ፕሮቲኖች ውስጥ የሚከሰቱ ሚውቴሽኖች የስር እድገትን ወደ የተዛባ ሊያመሩ ይችላሉ8,9,10,11,12,13። በተጨማሪም፣ እንደ ዳይሶፒራሚድ (ፕሪቲላክሎር በመባልም የሚታወቀው) ባሉ ማይክሮቱቡል የሚያበላሹ የአረም ማጥፊያ መድኃኒቶች የሚደረግ ሕክምና የግራ ጎን ዘንበል ያለ የስር እድገትን ያስከትላል14። እነዚህ መረጃዎች የእፅዋትን እድገት አቅጣጫ ለመወሰን የማይክሮቱቡል ተግባር ትክክለኛ ቁጥጥር ወሳኝ መሆኑን ያመለክታሉ።
የተለያዩ የማይክሮቱቡል አጋቾች ዓይነቶች ተገኝተዋል፣ እና እነዚህ መድሃኒቶች ለሳይቶስኬል ምርምር እንዲሁም ለግብርና እና ለህክምና ከፍተኛ አስተዋጽኦ አድርገዋል2። በተለይም ኦሪዛሊን፣ ዳይኒትሮአኒሊን ውህዶች፣ ዲሶፒራሚድ፣ ቤንዛሚድ-ተዛማጅ ውህዶች እና አናሎጎቻቸው የማይክሮቱቡል ተግባርን ሊገቱ እና በዚህም የእፅዋትን እድገት ሊገቱ ይችላሉ። ስለዚህ፣ እንደ አረም ማጥፊያ በሰፊው ጥቅም ላይ ይውላሉ። ሆኖም፣ ማይክሮቱቡል የእፅዋት እና የእንስሳት ሴሎች አስፈላጊ አካል ስለሆኑ፣ አብዛኛዎቹ የማይክሮቱቡል አጋቾች ለሁለቱም የሴል ዓይነቶች ሳይቶቶክሲክ ናቸው። ስለዚህ፣ እንደ አረም ማጥፊያዎች ቢታወቁም፣ የተወሰነ ቁጥር ያላቸው ፀረ-ማይክሮቱቡል ወኪሎች ለተግባራዊ ዓላማዎች ጥቅም ላይ ይውላሉ።
ስትሬፕቶማይሲስ የስትሮፕቶማይሲስ ቤተሰብ ዝርያ ሲሆን ኤሮቢክ፣ ግራም-አወንታዊ፣ ፋይመንተስ ባክቴሪያን የሚያካትት ሲሆን ሰፊ የሆነ ሁለተኛ ደረጃ ሜታቦላይቶችን የማምረት ችሎታ ስላለው በሰፊው ይታወቃል። ስለዚህ፣ ከአዳዲስ ባዮሎጂያዊ ንቁ የተፈጥሮ ምርቶች በጣም አስፈላጊ ምንጮች አንዱ እንደሆነ ይቆጠራል። በአሁኑ ጥናት፣ ከስትሬፕቶማይሲስ ዌርራኤንሲስ MK493-CF1 እና ኤስ. ዌርራኤንሲስ ISP 5486 የተነጠለ ኩማሞናሚድ የተባለ አዲስ ውህድ አግኝተናል። ስፔክትራል ትንተና እና ሙሉ ስፔክትራል ትንተናን በመጠቀም፣ የኩማሞናሚድ አወቃቀር ተለይቶ የሚታወቅ ሲሆን ልዩ የሆነው የN-alkoxypyrrole አፅም ተወስኗል። ውህደት። ኡርሶሞናሚድ እና ተዋጽኦዎቹ ሠራሽ መካከለኛ የሆነው ኡርሶሞኒክ አሲድ የታዋቂውን ሞዴል ተክል አራቢዶፕሲስ ታሊያና እድገት እና ማብቀልን የሚገታ ሆኖ ተገኝቷል። በመዋቅር-እንቅስቃሴ ግንኙነት ጥናት፣ C9 ያለው ውህድ ወደ ኡርሶኒክ አሲድ የተሻሻለ፣ ኖኒሎክሲ ዲሪዘቲቭ ኦፍ ኡርሶኒክ አሲድ (KAND)፣ በእድገት እና በማብቀል ላይ ያለውን የመከልከል ውጤት በከፍተኛ ሁኔታ እንደሚያሳድግ ደርሰንበታል። በተለይም፣ አዲስ የተገኘው የእፅዋት እድገት አጋቾች የትምባሆ እና የሊቨርዎርት እድገት ላይ ተጽዕኖ አሳድረዋል እንዲሁም ለባክቴሪያ ወይም ለሄላ ሴሎች ሳይቶቶክሲካል መርዛማ አልነበሩም። ከዚህም በላይ፣ አንዳንድ የurmotonic አሲድ ተዋጽኦዎች የተዛባ የስር ፍኖታይፕ ያስከትላሉ፣ ይህም እነዚህ ተዋጽኦዎች በቀጥታም ሆነ በተዘዋዋሪ ማይክሮቱቡሎችን እንደሚነኩ ያሳያል። ከዚህ ሀሳብ ጋር በሚስማማ መልኩ፣ በኢሚውኖሂስቶኬሚካላዊ ወይም በፍሎረሰንት ፕሮቲኖች የተሰየሙ ማይክሮቱቡሎችን የምናየው ምልከታ እንደሚያመለክተው የ KAND ሕክምና ማይክሮቱቡሎችን እንደሚያስወግድ ያሳያል። በተጨማሪም፣ በኩማሞቶኒክ አሲድ ተዋጽኦዎች የሚደረግ ሕክምና የአክቲን ማይክሮፋይላመንቶችን ያበላሻል። ስለዚህ፣ ልዩ የሆነ የተግባር ዘዴው ሳይቶስኬሌን ማጥፋትን የሚያካትት አዲስ የእፅዋት እድገት አጋጋቢ አግኝተናል።
ስቴይን MK493-CF1 በሺናጋዋ-ኩ፣ ቶኪዮ ከአፈር ተለይቷል። ስቴይን MK493-CF1 በደንብ የተቆራረጠ ስትሮማል ማይሴሊየም ፈጠረ። የ16S ራይቦሶማል አር ኤን ኤ ጂን ከፊል ቅደም ተከተል (1422 bp) ተወስኗል። ይህ ዝርያ ከኤስ. ዌርራንሲስ (NBRC 13404T = ISP 5486፣ 1421/1422 bp፣ T: typical spear, 99.93%) ጋር በጣም ተመሳሳይ ነው። በዚህ ውጤት ላይ በመመስረት፣ ይህ ዝርያ ከኤስ. ዌርራንሲስ አይነት ዝርያ ጋር በቅርበት የተቆራኘ መሆኑን ተወስኗል። ስለዚህ፣ ይህንን ዝርያ S. werranensis MK493-CF1 በጊዜያዊነት ሰየምነው። S. werranensis ISP 5486T ተመሳሳይ ባዮአክቲቭ ውህዶችንም ያመርታል። ከዚህ ማይክሮአኒዝም የተፈጥሮ ምርቶችን ለማግኘት ብዙም የመጀመሪያ ጥናት ስላልነበረ፣ ተጨማሪ የኬሚካል ምርምር ተካሂዷል። ኤስ. ዌርራኤንሲስ MK493-CF1 በገብስ መካከለኛ ላይ በ30°ሴ ለ14 ቀናት በጠጣር ሁኔታ መፍላት ከተመረተ በኋላ፣ መካከለኛው በ50% EtOH ተወግዷል። 59.5 ሚ.ግ ጥሬ ማውጣት ለማግኘት 60 ሚሊ ሊትር ናሙና ደርቋል። ጥሬው ማውጣት N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1፣ coumamonamide፣ 36.0 ሚ.ግ.) ለመስጠት በተገላቢጦሽ ደረጃ HPLC ተገድቧል። አጠቃላይ የ1 መጠን ጥሬው ማውጣት በግምት 60% ነው። ስለዚህ፣ የኩማቶአሚድ 1 ባህሪያትን በዝርዝር ለማጥናት ወስነናል።
ኩማሞናሚድ 1 ነጭ አሞርፎስ ዱቄት ሲሆን ከፍተኛ ጥራት ያለው የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ (HRESIMS) C6H8N2O2ን ያረጋግጣል (ምስል 1)። የዚህ ውህድ C2-ተተኪ የሆነው የፒሮል ቁራጭ በδH 6.94 (1H፣ t፣ J = 2.8፣ 4.8 Hz፣ H-4)፣ δH 6.78 (1H፣ d፣ J = 2.5፣ δH በ1H NMR ስፔክትረም፡ 4.5 Hz፣ H-5) እና δH 6.78 (1H፣ d፣ J = 2.5 Hz፣ H-6) ተለይቶ ይታወቃል፣ እና 13C NMR ስፔክትረም አራት sp2 የካርቦን አቶሞች መኖራቸውን ያሳያል። በC2 ቦታ ላይ የአሚድ ቡድን መኖር ከC-3 ፕሮቶን ወደ አሚድ ካርቦኒል ካርቦን በδC 161.1 ባለው የHMC ትስስር ተገምግሟል። በተጨማሪም፣ 1 H እና 13 C NMR በ δH 4.10 (3H፣ S) እና δC 68.3 ላይ ከፍተኛ ደረጃ ላይ ይደርሳሉ። የሜቶክሲው ቡድን ትክክለኛ አቀማመጥ እንደ የተሻሻለ ልዩነት ስፔክትሮስኮፒ እና የኑክሌር ኦቨርሃውዘር ምህጻረ ቃል (NOEDF) ባሉ ስፔክትሮስኮፒክ ትንተናዎች እስካሁን ባይወሰንም፣ N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide የመጀመሪያው እጩ ውህድ ሆነ።
የ1ን ትክክለኛ አወቃቀር ለመወሰን፣ አጠቃላይ ውህደት ተካሂዷል (ምስል 2a)። ለገበያ የቀረበ 2-አሚኖፒሪዲን 2 ከ m-CPBA ጋር የሚደረግ ሕክምና በ90°ሴ በቤንዚን ውስጥ ተመጣጣኝ N-ኦክሳይድ 3 በቁጥር ምርት አስገኝቷል። የ2-አሚኖአዚዴሽን ከተደረገ በኋላ፣ በአብራሞቪች የተገለጸው የሳይክሎኮንደንሴሽን ምላሽ በቤንዚን ውስጥ የተፈለገውን 1-ሃይድሮክሲ-1H-ፒሮል-2-ካርቦኒትሪል 5 ግራም ለማግኘት ተካሂዷል። ፍጥነት 60% (ሁለት ደረጃዎች)። 15,16. ከዚያም የ4 ሜቲሌሽን እና ሃይድሮሊሲስ 1-ሜቶክሲ-1H-ፒሮል-2-ካርቦክሲሊክ አሲድ (“ኩሞቶኒክ አሲድ”፣ 6 ተብሎ የሚጠራው) በጥሩ ምርት (70%፣ ሁለት ደረጃዎች) ሰጥተዋል። በመጨረሻም፣ በውሃ አሞኒያ በመጠቀም በአሲድ ክሎራይድ መካከለኛ 6 በኩል አሚዴሽን በ98% ምርት ውስጥ ለኩማሞቶ አሚድ 1 ሰጥቷል። የተቀናበረ 1 ሁሉም ስፔክትራል መረጃዎች ከተገለለ 1 ጋር ተመሳሳይ ነበሩ፣ ስለዚህ የ1 አወቃቀር ተወስኗል፤
የኡርቤናሚድ እና የኡርቤኒክ አሲድ ባዮሎጂያዊ እንቅስቃሴ አጠቃላይ ውህደት እና ትንተና። (ሀ) የኩማሞቶ አሚድ አጠቃላይ ውህደት። (ለ) የሰባት ቀን የዱር አይነት የአራቢዶፕሲስ ኮሎምቢያ (ኮል) ችግኞች በተጠቀሰው ክምችት ላይ ኩማሞናሚድ 6 ወይም ኩማሞናሚድ 1 በያዙ የሙራሺጌ እና የስኮግ (ኤምኤስ) ሳህኖች ላይ ተተክለዋል። የስኬል አሞሌ = 1 ሴ.ሜ.
በመጀመሪያ፣ የኡርቤናሚድ እና የመሃል ክፍሎቹን ባዮሎጂያዊ እንቅስቃሴዎች የእፅዋትን እድገት የመቆጣጠር ችሎታቸውን ገምግመናል። በዚህ መካከለኛ ክፍል ላይ የኤምኤስ አጋር መካከለኛ እና የተለማመዱ የአረብቢዶፕሲስ ታሊያና ችግኞችን የተለያዩ የኡርሰሞናሚድ 1 ወይም የኡርሰሞኒክ አሲድ 6 ክምችቶችን ጨምረናል። እነዚህ ምርመራዎች ከፍተኛ ክምችት (500 μM) የ6 የስር እድገትን እንዳገቱ አሳይተዋል (ምስል 2ለ)። በመቀጠል፣ የ6 N1 ቦታን በመተካት የተለያዩ ተዋጽኦዎችን ፈጠርን እና በእነሱ ላይ የመዋቅር-እንቅስቃሴ ግንኙነት ጥናቶችን አከናውነናል (የአናሎግ ውህደት ሂደት በድጋፍ መረጃ (SI) ውስጥ ተገልጿል)። የአረብቢዶፕሲስ ችግኞች 50 μM የኡርሰኒክ አሲድ ተዋጽኦዎችን በያዘ መካከለኛ ክፍል ላይ ይበቅላሉ፣ እና የስር ርዝመቱ በስዕሉ ላይ እንደሚታየው ተለክቷል። በስእል 3a፣ b እና S1 ላይ እንደሚታየው፣ የኩማሞ አሲዶች በN1 ቦታ ላይ የተለያዩ የመስመራዊ አልኮክሲ ሰንሰለቶች (9፣ 10፣ 11፣ 12 እና 13) ወይም ትላልቅ የአልኮክሲ ሰንሰለቶች (15፣ 16 እና 17) ርዝመት አላቸው። ተዋጽኦዎቹ የስር እድገትን በእጅጉ እንደሚገታ አሳይተዋል። በተጨማሪም፣ 200 μM 10፣ 11 ወይም 17 መተግበር መበቅለጡን እንዳቆመ ደርሰንበታል (ምስል 3c እና S2)።
የኩማሞቶ አሚድ እና ተዛማጅ ውህዶች የመዋቅር-እንቅስቃሴ ግንኙነት ጥናት። (ሀ) የአናሎጎች አወቃቀር እና ውህደት እቅድ። (ለ) በኤምኤስ መካከለኛ ላይ የሚበቅሉ የ7 ቀን ችግኞች የስር ርዝመት በቁጥር 50 μM የኩማሞናሚድ ተዋጽኦዎች ወይም የሌላቸው። ኮስተሮች በሻም ህክምና ላይ ጉልህ ልዩነቶችን ያመለክታሉ (t test፣ p< 0.05)። n>18. መረጃው እንደ አማካይ ± SD ይታያል። nt ማለት ከ50% በላይ የሚሆኑት ዘሮች ስላላበቀሉ "አልተፈተነም" ማለት ነው። (ሐ) በኤምኤስ መካከለኛ ውስጥ ለ7 ቀናት የታከሙ ዘሮች የመራባት መጠን በቁጥር 200 μM ኩማሞናሚድ እና ተዛማጅ ውህዶች። ኮስተሮች ከሻም ህክምና (ቺ-ካሬ ምርመራ) ጋር ጉልህ ልዩነቶችን ያመለክታሉ። n=96።
የሚገርመው ነገር፣ ከC9 በላይ የሆኑ የአልኪል የጎን ሰንሰለቶች መጨመር የመከልከል እንቅስቃሴን ቀንሷል፣ ይህም ከኩማቶቲክ አሲድ ጋር የተያያዙ ውህዶች ባዮሎጂያዊ እንቅስቃሴያቸውን ለማሳየት የተወሰነ መጠን ያላቸው የጎን ሰንሰለቶች እንደሚያስፈልጉ ይጠቁማል።
የመዋቅር-እንቅስቃሴ ግንኙነት ትንተና እንደሚያሳየው C9 ወደ ኡርሶኒክ አሲድ እንደተቀየረ እና የኡርሶኒክ አሲድ ኖኒሎክሲ ተዋጽኦ (ከዚህ በኋላ KAND 11 ተብሎ የሚጠራው) በጣም ውጤታማ የእፅዋት እድገት አጋች በመሆኑ፣ የ KAND 11ን የበለጠ ዝርዝር መግለጫ አድርገናል። የአረብዲፖሲስ ሕክምና በ50 μM KAND 11 ማብቀል ሙሉ በሙሉ ማለት ይቻላል እንዳይበቅል ይከላከላል፣ ዝቅተኛ ክምችት (40፣ 30፣ 20፣ ወይም 10 μM) የ KAND 11 የስር እድገትን በመጠን ጥገኛ በሆነ መንገድ አግዷል (ምስል 4a፣ ለ)። KAND 11 የስር ሜሪስቴም ህያውነትን ይጎዳ እንደሆነ ለመፈተሽ፣ በፕሮፒዲየም አዮዳይድ (PI) የተነከሩ የስር ሜሪስቴሞችን መርምረናል እና የሜሪስቴም አካባቢ መጠንን ለካን። 25 μM KAND-11 በያዘ መካከለኛ ቦታ ላይ የሚበቅሉት ችግኞች ሜሪስቴም መጠን 151.1 ± 32.5 μm ሲሆን፣ DMSO በያዘ መቆጣጠሪያ መካከለኛ ቦታ ላይ የሚበቅሉት ችግኞች ሜሪስቴም መጠን 264.7 ± 30.8 μm ነበር (ምስል 4c፣ መ)፣ ይህም KAND-11 የሴሉላር እንቅስቃሴን ወደነበረበት እንደሚመልስ ያሳያል። መስፋፋትን ያሳያል። የስር ሜሪስቴም። ከዚህ ጋር በሚስማማ መልኩ፣ የ KAND 11 ሕክምና በስር ሜሪስቴም ውስጥ የሴል ክፍፍል ምልክት CDKB2፤1p::CDKB2;1-GUS ምልክት መጠን ቀንሷል (ምስል 4e) 17። እነዚህ ውጤቶች KAND 11 የሴል እድገት እንቅስቃሴን በመቀነስ የስር እድገትን እንደሚገታ ያመለክታሉ።
የኡርቤኖኒክ አሲድ ተዋጽኦዎች (urbenyloxy ተዋጽኦዎች) በእድገት ላይ የሚያሳድሩትን የመከልከል ውጤት ትንተና። (ሀ) በኤምኤስ ሳህኖች ላይ የሚበቅሉ የ7-ቀን የዱር አይነት የኮል ችግኞች የተጠቆመው የ KAND 11 ክምችት። የስኬል አሞሌ = 1 ሴ.ሜ። (ለ) የስር ርዝመት ቁጥራዊነት። ፊደሎች ጉልህ ልዩነቶችን ያመለክታሉ (የTukey HSD ምርመራ፣ ገጽ< 0.05)። n>16. መረጃው እንደ አማካይ ± SD ይታያል። (ሐ) በኤምኤስ ሳህኖች ላይ የሚበቅሉ የፕሮፒዲየም አዮዳይድ-የተሸፈነ የዱር-አይነት የኮል ሥሮች ኮንፎካል ማይክሮስኮፒ 25 μM KAND 11 ያላቸው ወይም የሌላቸው። ነጭ ቅንፎች የስር ሜሪስቴም ያመለክታሉ። የመለኪያ አሞሌ = 100 µm። (መ) የስር ሜሪስቴም መጠን መጠን (n = 10 እስከ 11)። የስታቲስቲክስ ልዩነቶች የተወሰኑት በቲ-ሙከራ (p) በመጠቀም ነው< 0.05)። አሞሌዎቹ አማካይ የሜሪስቴም መጠንን ይወክላሉ። (ሠ) የCDKB2 ግንባታን የያዘ የስር ሜሪስቴም የዲፈረንሻል ጣልቃ ገብነት ንፅፅር (DIC) ማይክሮስኮፒ፤ 1ፕሮ፡ CDKB2፤ 25 µM የKAND ምርመራ በማድረግ ወይም በሌላቸው በMS ሳህኖች ላይ በሚበቅሉ የ5 ቀን ችግኞች ላይ 1-GUS የተቀባ እና የተቀባ።
የ KAND 11 የፊቶቶክሲዝም ምርመራ ሌላ ዲኮቲሌዶነስ ተክል፣ ትምባሆ (ኒኮቲያና ታባኩም) እና ዋና የመሬት ተክል ሞዴል ኦርጋኒክ፣ ሊቨርዎርት (ማርቻንቲያ ፖሊሞርፋ) በመጠቀም ተፈትኗል። ልክ እንደ አረብቢዶፕሲስ፣ 25 μM KAND 11 በያዘ መካከለኛ ቦታ ላይ የሚበቅሉ የትምባሆ SR-1 ችግኞች አጫጭር ሥሮችን አፍርተዋል (ምስል 5a)። በተጨማሪም፣ ከ48ቱ ዘሮች ውስጥ 40ቱ 200 μM KAND 11 በያዙ ሳህኖች ላይ ይበቅላሉ፣ 48ቱ ዘሮች ደግሞ በሞክ-ታክመው በሚሰጥ ሚዲያ ላይ ይበቅላሉ፣ ይህም ከፍተኛ የ KAND ክምችት ከፍተኛ መሆኑን ያሳያል (ገጽ 1)< 0.05፤ chi test -square) የትምባሆ መበቀልን አግዷል። (ምስል 5ለ)። በተጨማሪም፣ በሊቨርዎርት ውስጥ የባክቴሪያ እድገትን የሚገታ የ KAND 11 ክምችት በአረብቢዶፕሲስ ውስጥ ካለው ውጤታማ ክምችት ጋር ተመሳሳይ ነበር (ምስል 5ሐ)። እነዚህ ውጤቶች KAND 11 የተለያዩ እፅዋትን እድገት ሊገታ እንደሚችል ያመለክታሉ። ከዚያም በሌሎች ፍጥረታት ውስጥ ከድብ ሞኖአሚድ ጋር የተያያዙ ውህዶችን ማለትም የሰው ሄላ ሴሎችን እና የኤሼሪቺያ ኮላይ ዝርያ DH5αን በቅደም ተከተል እንደ ከፍተኛ የእንስሳት እና የባክቴሪያ ሴሎች ተወካዮች ሊሆኑ የሚችሉ ሳይቶቶክሲክነቶችን መርምረናል። በተከታታይ የሴል ፕሮፓጋንዳ ምርመራዎች፣ ኩማሞናሚድ 1፣ ኩማሞናሚዲክ አሲድ 6 እና KAND 11 በ100 μM ክምችት ላይ የሄላ ወይም የኢ. ኮላይ ሴሎችን እድገት ላይ ተጽዕኖ እንዳላሳደሩ ተመልክተናል (ምስል 5d፣e)።
የአረብ-አልባ ህዋሳት በሆኑ የ KAND 11 የእድገት መከልከል። (ሀ) የሁለት ሳምንት የዱር አይነት SR-1 የትምባሆ ችግኞች በአቀባዊ በተቀመጡ የ MS ሳህኖች ላይ 25 μM KAND 11 በያዙ። (ለ) የሁለት ሳምንት የዱር አይነት SR-1 የትምባሆ ችግኞች 200 μM KAND 11 በያዙ አግድም በተቀመጡ የ MS ሳህኖች ላይ ተተክለዋል። (ሐ) የሁለት ሳምንት የዱር አይነት Tak-1 የሊቨርዎርት ቡቃያዎች በጋምበርግ B5 ሳህኖች ላይ የተተከሉ እና የ KAND 11 ክምችት ያላቸው። ቀይ ቀስቶች በሁለት ሳምንት የመታቀፊያ ጊዜ ውስጥ ማደግ ያቆሙ ስፖሮችን ያመለክታሉ። (መ) የሄላ ሴሎች የሴል እድገት ምርመራ። የሚንቀሳቀሱ ሴሎች ብዛት በተወሰነ የጊዜ ልዩነት በሴል ቆጠራ ኪት 8 (ዶጂንዶ) በመጠቀም ተለክቷል። እንደ መቆጣጠሪያ፣ የሄላ ሴሎች በ5 μg/ml አክቲኖማይሲን ዲ (Act D) ታክመዋል፣ ይህም የRNA ፖሊሜሬዝ ግልባጭን የሚገታ እና የሴል ሞትን ያስከትላል። ትንታኔዎች በሦስት እጥፍ ተከናውነዋል። (ሠ) የኢ. ኮላይ ሴል እድገት ምርመራ። የኢ. ኮላይ እድገት የተተነተነው OD600ን በመለካት ነው። እንደ መቆጣጠሪያ፣ ሴሎች በ50 μg/ml አሚፒሲሊን (አምፕ) ታክመዋል፣ ይህም የባክቴሪያ ሴል ግድግዳ ውህደትን ይከለክላል። ትንታኔዎቹ በሦስት እጥፍ ተከናውነዋል።
ከኡራሚድ ጋር በተያያዙ ውህዶች ምክንያት የሚከሰተውን የሳይቶቶክሲካል እርምጃ ዘዴ ለመረዳት፣ መካከለኛ የመከላከል ተፅእኖ ያላቸውን የኡርቤኒክ አሲድ ተዋጽኦዎችን እንደገና ተንትነናል። በስዕሉ ላይ እንደሚታየው። በስእል 2ለ፣ 6a ላይ እንደሚታየው፣ ከፍተኛ ክምችት (200 μM) የኡርሞቶኒክ አሲድ 6 ባላቸው የአጋር ሳህኖች ላይ የሚበቅሉ ችግኞች አጠር ያሉ እና ግራ የተጠማዘዙ ሥሮችን ያመነጫሉ (θ = – 23.7 ± 6.1)፣ በቁጥጥር መካከለኛ ላይ ከሚበቅሉት ችግኞች መካከል ችግኞቹ ቀጥ ያሉ ሥሮችን ያመርታሉ (θ = – 3.8 ± 7.1)። ይህ ባህሪያዊ ገደድ እድገት የሚከሰተው በኮርቲካል ማይክሮቱቡሎች14,18 ችግር ምክንያት እንደሆነ ይታወቃል። ከዚህ ግኝት ጋር በሚስማማ መልኩ፣ ማይክሮቱቡል-አረጋጋጭ መድኃኒቶች ዳይሶፒራሚድ እና ኦሪዛሊን በእድገታችን ሁኔታ ስር ተመሳሳይ የስር ዘንበል እንዲሉ አድርገዋል (ስዕሎች 2ለ፣ 6a)። በተመሳሳይ ጊዜ፣ የኡርሞቶኒክ አሲድ ተዋጽኦዎችን ሞክረን የተወሰኑትን መርጠናል፣ በተወሰኑ ክምችቶች፣ ገደድ የስር እድገትን ያስከትላሉ። ውህዶች 8፣ 9 እና 15 በቅደም ተከተል የስር እድገት አቅጣጫን በ75 μM፣ 50 μM እና 40 μM ቀይረውታል፣ ይህም እነዚህ ውህዶች ማይክሮቱቡሎችን ውጤታማ በሆነ መንገድ ሊያበላሹ እንደሚችሉ ያሳያል (ምስል 2ለ፣ 6a)። እንዲሁም በጣም ኃይለኛ የሆነውን የዩርሶሊክ አሲድ ተዋጽኦ የሆነውን KAND 11 በዝቅተኛ ክምችት (15 µM) ሞክረን የ KAND 11 አተገባበር የስር እድገትን እንደሚገታ እና የስር እድገት አቅጣጫ ያልተስተካከለ መሆኑን አረጋግጠናል፣ ምንም እንኳን ወደ ግራ ያዘነብላሉ (ምስል C3)። ማይክሮቱቡል-አረጋጋጭ መድኃኒቶች ከፍተኛ ክምችት አንዳንድ ጊዜ የስር ማዘንበል ከማስከተል ይልቅ የእፅዋትን እድገት ስለሚከለክል፣ በኋላ ላይ KAND 11 በስር ኤፒደርማል ሴሎች ውስጥ ኮርቲካል ማይክሮቱቡሎችን በመመልከት ማይክሮቱቡሎችን ሊጎዳ እንደሚችል ገምግመናል። በ25 μM KAND 11 የታከሙ የችግኝ ሥሮች ኤፒደርማል ሴሎች ውስጥ ፀረ-β-ቱቡሊን ፀረ እንግዳ አካላትን በመጠቀም ኢሚውኖሂስቶኬሚስትሪ በማራዘሚያ ዞን ውስጥ በኤፒደርማል ሴሎች ውስጥ ማለት ይቻላል ሁሉም ኮርቲካል ማይክሮቱቡሎች መጥፋት አሳይቷል (ምስል 6ለ)። እነዚህ ውጤቶች ኩማሞቶኒክ አሲድ እና ተዋጽኦዎቹ በቀጥታም ሆነ በተዘዋዋሪ በማይክሮቱቡሎች ላይ ተጽዕኖ ለማሳደር እንደሚሰሩ እና እነዚህ ውህዶች አዳዲስ የማይክሮቱቡል አጋቾች መሆናቸውን ያመለክታሉ።
ኡርሶኒክ አሲድ እና ተዋጽኦዎቹ በአረብቢዶፕሲስ ታሊያና ውስጥ ያለውን ኮርቲካል ማይክሮቱቡሎችን ይለውጣሉ። (ሀ) በተጠቀሱት ክምችቶች ላይ የተለያዩ የኡርሞቶኒክ አሲድ ተዋጽኦዎች ባሉበት የሚለካው የስር ዝንባሌ አንግል። ማይክሮቱቡሎችን እንደሚከላከሉ የሚታወቁ ሁለት ውህዶች ውጤቶች፡ ዳይሶፒራሚድ እና ኦሪዛሊንም ተተነተኑ። ኢንሴቱ የስር እድገት አንግልን ለመለካት ጥቅም ላይ የዋለውን መስፈርት ያሳያል። ኮስተሮች በሻም ህክምና ላይ ጉልህ ልዩነቶችን ያመለክታሉ (t test, p< 0.05)። n>19. የስኬል አሞሌ = 1 ሴ.ሜ. (ለ) በኤፒደርማል ሴሎች ውስጥ ኮርቲካል ማይክሮቱቡሎች በማራዘሚያ ዞን ውስጥ። በዱር ዓይነት አረብቢዶፕሲስ ውስጥ ያሉ ማይክሮቱቡሎች 25 μM KAND 11 ያላቸው ወይም የሌላቸው በኤምኤስ ሳህኖች ላይ የሚበቅሉ ማይክሮቱቡሎች በβ-ቱቡሊን ዋና ፀረ እንግዳ አካላት እና በአሌክሳ ፍሎር-የተያያዙ ሁለተኛ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካላትን በመጠቀም በኢሚውኖሂስቶኬሚካል ቀለም ታይተዋል። የስኬል አሞሌ = 10 µm. (ሐ) በሥሩ ሜሪስቴም ውስጥ ያሉ የማይክሮቱቡሎች ሚቶቲክ መዋቅር። ማይክሮቱቡሎች በኢሚውኖሂስቶኬሚካል ቀለም ታይተዋል። የፕሮፋዝ ዞኖችን፣ ስፒንዶችን እና ፍራግሞፕላስትን ጨምሮ ሚቶቲክ መዋቅሮች ከኮንፎካል ምስሎች ተቆጥረዋል። ቀስቶች ሚቶቲክ ማይክሮቱቡል መዋቅሮችን ያመለክታሉ። ኮስተሮች በሻም ሕክምና ላይ ጉልህ ልዩነቶችን ያመለክታሉ (t test፣ p< 0.05)። n>9. የመለኪያ አሞሌ = 50 µm።
ኡርሳ የማይክሮቱቡል ተግባርን የማስተጓጎል ችሎታ ቢኖረውም፣ የተግባር አሠራሩ ከተለመደው የማይክሮቱቡል ዲፖሊሜራይዜሽን ወኪሎች የተለየ እንደሚሆን ይጠበቃል። ለምሳሌ፣ እንደ ዲሶፒራሚድ እና ኦሪዛሊን ያሉ ከፍተኛ የማይክሮቱቡል ዲፖሊሜራይዜሽን ወኪሎች ክምችት የኤፒደርማል ሴሎችን አኒሶትሮፒክ መስፋፋትን ያስከትላሉ፣ KAND 11 ግን አያመጣም። በተጨማሪም፣ የ KAND 11 እና የዲሶፒራሚድ በጋራ መተግበር የተቀናጀ የዲሶፒራሚድ-የተፈጠረ የስር እድገት ምላሽ አስከትሏል እና የ KAND 11-የተፈጠረ የእድገት መከልከል ታይቷል (ምስል S4)። እንዲሁም ከፍተኛ ስሜታዊነት ያለው ዲሶፒራሚድ 1-1 (phs1-1) ሚውቴሽን ለ KAND 11 ምላሽ ተንትነናል። phs1-1 ቀኖናዊ ያልሆነ የቱቡሊን ኪናሴ ነጥብ ሚውቴሽን ያለው ሲሆን በዲሶፒራሚድ9,20 ሲታከም አጫጭር ሥሮችን ያመነጫል። KAND 11ን በያዘው የአጋር መካከለኛ ላይ የሚበቅሉ የphs1-1 ሚውቴሽን ችግኞች በዲሶፒራሚድ ላይ ከሚበቅሉት ጋር ተመሳሳይ የሆኑ አጫጭር ሥሮች አሏቸው (ምስል S5)።
በተጨማሪም፣ በKAND 11 የታከሙ ችግኞች ስር ሜሪስቴም ውስጥ እንደ ፕሮፋዝ ዞኖች፣ ስፒንዶች እና ፍራግሞፕላስት ያሉ ሚቶቲክ ማይክሮቱቡል አወቃቀሮችን ተመልክተናል። ከCDKB2;1p::CDKB2;1-GUS ምልከታዎች ጋር በሚስማማ መልኩ፣ በሚቶቲክ ማይክሮቱቡሎች ብዛት ላይ ጉልህ የሆነ ቅናሽ ታይቷል (ምስል .6c)።
የ KAND 11ን ሳይቶቶክሲክነት በንዑስ ሴሉላር ጥራት ለመለየት፣ የትምባሆ BY-2 እገዳ ሴሎችን በ KAND 11 አከምን እና ምላሻቸውን ተመልክተናል። በመጀመሪያ KAND 11ን ወደ TagRFP-TUA6 የሚገልጹ BY-2 ሴሎች አክለናል፣ ይህም ማይክሮቱቡሎችን በፍሎረሰንት መልኩ መለያ የሚያደርገው፣ በኮርቲካል ማይክሮቱቡሎች ላይ ያለውን ተጽእኖ ለመገምገም ነው። የኮርቲካል ማይክሮቱቡል ጥግግት የተገመገመው በምስል ትንተና ሲሆን ይህም በሳይቶፕላዝሚክ ፒክስሎች መካከል ያለውን የሳይቶስኬሌት ፒክስሎች መቶኛ ይለካ ነበር። የምርመራው ውጤት እንደሚያሳየው በ50 μM ወይም 100 μM KAND 11 ለ1 ሰዓት ከታከመ በኋላ ጥግግቱ በከፍተኛ ሁኔታ ወደ 0.94 ± 0.74% ወይም 0.23 ± 0.28% በቅደም ተከተል ቀንሷል፣ በDMSO የታከሙት ሴሎች ጥግግት ደግሞ 1.61 ± 0.34% ደርሷል (ምስል 7a)። እነዚህ ውጤቶች በአረቢዶፕሲስ ውስጥ የ KAND 11 ሕክምና የኮርቲካል ማይክሮቱቡሎችን ዲፖሊሜራይዜሽን እንደሚያመጣ ከሚገልጸው ምልከታ ጋር የሚጣጣሙ ናቸው (ምስል 6ለ)። እንዲሁም ተመሳሳይ የ KAND 11 ክምችት ካለው ሕክምና በኋላ በGFP-ABD-labeled actin filaments BY-2 መስመርን መርምረናል እና የ KAND 11 ሕክምና የአክቲን ክሮች እንዳስተጓጎለ ተመልክተናል። በ50 μM ወይም 100 μM KAND 11 ሕክምና ለ1 ሰዓት የአክቲን ክሮች ጥግግት በከፍተኛ ሁኔታ ወደ 1.20 ± 0.62% ወይም 0.61 ± 0.26% ቀንሷል፣ በDMSO የታከሙ ሴሎች ውስጥ ያለው ጥግግት ደግሞ 1.69 ± 0.51% ነበር (ምስል 2)። 7ለ)። እነዚህ ውጤቶች ከአክቲን ክሮች ጋር የማይነካው ፕሮፒዛሚድ እና ማይክሮቱቡሎችን የማይነካው ላቱንሩኩሊን ቢ ከሚባለው የአክቲን ዲፖሊሜራይዘር ውጤቶች ጋር ይቃረናሉ (SI ምስል S6)። በተጨማሪም፣ በኩማሞናሚድ 1፣ በኩማሞናሚድ አሲድ 6 ወይም በኬንድ 11 የሚደረግ ሕክምና በሄላ ሴሎች ውስጥ ባሉ ማይክሮቱቡሎች ላይ ተጽዕኖ አላሳደረም (SI ምስል S7)። ስለዚህ፣ የKAND 11 የተግባር ዘዴ ከሚታወቁት የሳይቶስክሌተን ረብሻዎች የተለየ እንደሆነ ይታመናል። በተጨማሪም፣ በኬንድ 11 የታከሙ የBY-2 ሴሎችን በአጉሊ መነጽር መመልከታችን በኬንድ 11 ሕክምና ወቅት የሕዋስ ሞት መጀመሩን አሳይቷል እና የኢቫንስ ሰማያዊ ቀለም ያላቸው የሞቱ ሴሎች መጠን ከኬንድ 11 ሕክምና 30 ደቂቃ በኋላ በከፍተኛ ሁኔታ እንዳልጨመረ አሳይቷል፣ በ50 μM ወይም 100 μM KAND ሕክምና 90 ደቂቃ ከተደረገ በኋላ የሞቱ ሴሎች ቁጥር በቅደም ተከተል ወደ 43.7% ወይም 80.1% አድጓል (ምስል 7ሐ)። እነዚህ መረጃዎች አንድ ላይ ሲወሰዱ፣ አዲሱ የዩርሶሊክ አሲድ ተዋጽኦ KAND 11 ከእፅዋት ጋር የተያያዘ ሳይቶስክሌታል አጋች መሆኑን ያመለክታሉ፣ ከዚህ በፊት ያልታወቀ የድርጊት ዘዴ አለው።
KAND የኮርቲካል ማይክሮቱቡሎችን፣ የአክቲን ክሮች እና የትምባሆ BY-2 ሴሎችን ሕያውነት ይነካል። (ሀ) በBY-2 ሴሎች ውስጥ TagRFP-TUA6 ፊት የኮርቲካል ማይክሮቱቡሎችን በእይታ ማሳየት። በKAND 11 (50 μM ወይም 100 μM) ወይም DMSO የታከሙ BY-2 ሴሎች በኮንፎካል ማይክሮስኮፒ ተመርምረዋል። ​​የኮርቲካል ማይክሮቱቡል ጥግግት የተሰላው ከ25 ገለልተኛ ሴሎች ማይክሮግራፍ ነው። ፊደላት ጉልህ ልዩነቶችን ያመለክታሉ (የTukey HSD ምርመራ፣ p< 0.05)። የስኬል አሞሌ = 10 µm። (ለ) በGFP-ABD2 ፊት የሚታዩት በBY-2 ሴሎች ውስጥ ያሉት ኮርቲካል አክቲን ክሮች። በKAND 11 (50 μM ወይም 100 μM) ወይም DMSO የታከሙ BY-2 ሴሎች በኮንፎካል ማይክሮስኮፒ ተመርምረዋል። ​​የኮርቲካል አክቲን ክሮች ጥግግት የተሰላው ከ25 ገለልተኛ ሴሎች ማይክሮግራፎች ነው። ፊደላት ጉልህ ልዩነቶችን ያመለክታሉ (የTukey HSD ምርመራ፣ p< 0.05)። የስኬል አሞሌ = 10 µm። (ሐ) የሞቱ BY-2 ሴሎችን በኢቫንስ ሰማያዊ ቀለም መመልከቻ። በ KAND 11 (50 μM ወይም 100 μM) ወይም DMSO የታከሙ BY-2 ሴሎች በብሩህ-ፊልድ ማይክሮስኮፒ ተመርምረዋል። ​​n=3። የስኬል አሞሌ = 100 µm።
አዳዲስ የተፈጥሮ ምርቶች ግኝት እና አተገባበር በሰው ልጅ ሕይወት ውስጥ በተለያዩ ገጽታዎች ማለትም በሕክምና እና በግብርና ላይ ከፍተኛ እድገት አስገኝቷል። ከተፈጥሮ ሀብቶች ጠቃሚ ውህዶችን ለማግኘት ታሪካዊ ምርምር ተደርጓል። በተለይም አክቲኖሚሴቴቶች እንደ አቨርሜክቲን ያሉ የተለያዩ ሁለተኛ ደረጃ ሜታቦላይቶችን የማምረት ችሎታ ስላላቸው ለኔማቶዶች እንደ ፀረ-ተባይ አንቲባዮቲኮች ጠቃሚ እንደሆኑ ይታወቃል፣ ይህም የኢቨርሜክቲን እና የብሌኦሚሲን እና ተዋጽኦዎቹ እንደ ፀረ-ካንሰር ወኪል ጥቅም ላይ ይውላሉ21,22። በተመሳሳይ፣ ከአክቲኖሚሴቴስ የተለያዩ የእፅዋት ማጥፊያ ውህዶች ተገኝተዋል፣ አንዳንዶቹ ቀድሞውኑ ለንግድ ጥቅም ላይ ይውላሉ1,23። ስለዚህ፣ ተፈጥሯዊ ምርቶችን ከተፈለገ ባዮሎጂያዊ እንቅስቃሴ ጋር ለመለየት የአክቲኖሚሴቴ ሜታቦላይቶችን መተንተን ውጤታማ ስትራቴጂ ተደርጎ ይቆጠራል። በዚህ ጥናት፣ ከኤስ. ዌርራንሲስ አዲስ ውህድ፣ ኩማሞናሚድ፣ አግኝተን በተሳካ ሁኔታ አቀናብረነዋል። ኡርሶኒክ አሲድ የኡርቤናሚድ እና ተዋጽኦዎቹ ሰው ሰራሽ መካከለኛ ነው። የስር ኩርባን ሊያስከትል፣ መካከለኛ እስከ ጠንካራ የእፅዋት ማጥፊያ እንቅስቃሴን ሊያሳይ እና በቀጥታም ሆነ በተዘዋዋሪ የእፅዋት ማይክሮቱቡሎችን ሊጎዳ ይችላል። ይሁን እንጂ፣ የኡርሞቶኒክ አሲድ የተግባር ዘዴ ከነባር ማይክሮቱቡል አጋቾች ሊለይ ይችላል፣ ምክንያቱም KAND 11 የአክቲን ክሮችን ስለሚያበላሽ እና የሕዋስ ሞትን ስለሚያስከትል፣ ይህም ኡርሞቶኒክ አሲድ እና ተዋጽኦዎቹ በተለያዩ የሳይቶስ አፅም መዋቅሮች ላይ ተጽዕኖ የሚያሳድሩበትን የቁጥጥር ዘዴ ይጠቁማል።
የኡርቤኖኒክ አሲድ ተጨማሪ ዝርዝር መግለጫ የኡርቤኖኒክ አሲድ የድርጊት ዘዴን በተሻለ ሁኔታ ለመረዳት ይረዳል። በተለይም የሚቀጥለው ግብ ኡርሶኒክ አሲድ እና ተዋጽኦዎቹ በቀጥታ በማይክሮቱቡሎች ላይ እንደሚሠሩ እና ፖሊመሪዝ እንደሚያደርጉ ወይም ተግባራቸው ማይክሮቱቡል እንዳይረጋጋ እንደሚያደርግ ለመወሰን የኡርሶኒክ አሲድ ከተቀነሰ ማይክሮቱቡሎች ጋር የመተሳሰር ችሎታን መገምገም ነው፣ ወይም ተግባራቸው ማይክሮቱቡል እንዳይረጋጋ ያደርጋል። በተጨማሪም፣ ማይክሮቱቡሎች ቀጥተኛ ኢላማ ካልሆኑ፣ በእፅዋት ሴሎች ላይ የኡርሶኒክ አሲድ የድርጊት ቦታ እና ሞለኪውላዊ ኢላማዎችን መለየት ተዛማጅ ውህዶች ባህሪያትን እና የእፅዋት ማጥፊያ እንቅስቃሴን ለማሻሻል ሊሆኑ የሚችሉ መንገዶችን የበለጠ ለመረዳት ይረዳል። የባዮአክቲቪቲ ምርመራችን እንደ አረብቢዶፕሲስ ታሊያና፣ ትምባሆ እና ሊቨርዎርት ባሉ ተክሎች እድገት ላይ የዩርሶኒክ አሲድ ልዩ የሳይቶቶክሲክ ችሎታን አሳይቷል፣ ኢ. ኮላይም ሆነ ሄላ ሴሎች አልተጎዱም። ለእንስሳት ሴሎች ምንም አይነት መርዛማነት የለም ወይም የለም፣ ክፍት በሆኑ የግብርና መስኮች ውስጥ ጥቅም ላይ እንዲውሉ እንደ አረቢዎች ከተዘጋጁ የዩርሶኒክ አሲድ ተዋጽኦዎች ጥቅም ነው። በእርግጥ፣ ማይክሮቱቡሎች በዩካርዮትስ ውስጥ የተለመዱ መዋቅሮች ስለሆኑ፣ በእፅዋት ውስጥ የሚመረጡ መከልከላቸው ለፀረ-አረም መድኃኒቶች ቁልፍ መስፈርት ነው። ለምሳሌ፣ ፕሮፒዛሚድ፣ ከቱቡሊን ጋር በቀጥታ የሚገናኝ እና ፖሊመሪዜሽንን የሚገታ ማይክሮቱቡል ዲፖሊሜራይዜሽን ወኪል፣ ለእንስሳት ሴሎች ዝቅተኛ መርዛማነት ስላለው እንደ ፀረ-ተባይ መድኃኒት ሆኖ ያገለግላል24። ከዲሶፒራሚድ በተቃራኒ፣ ተዛማጅ ቤንዛሚዶች የተለያዩ የታለሙ ልዩ ባህሪያት አሏቸው። ከእፅዋት ማይክሮቱቡሎች በተጨማሪ፣ RH-4032 ወይም ቤንዞክአሚድ እንዲሁም የእንስሳት ሴሎችን ወይም ኦማይሴቶችን ማይክሮቱቡሎችን በቅደም ተከተል ይከለክላል፣ እና ዛሊላሚድ በዝቅተኛ የፊቶቶክሲክነት ምክንያት እንደ ፈንገስ መድኃኒት ሆኖ ያገለግላል25,26,27። አዲስ የተገኘው ድብ እና ተዋጽኦዎቹ በእፅዋት ላይ የተመረጡ ሳይቶቶክሲክነትን ያሳያሉ፣ ነገር ግን ተጨማሪ ማሻሻያዎች የታለመውን ልዩነታቸውን ሊለውጡ እንደሚችሉ ልብ ሊባል የሚገባው ሲሆን ይህም በሽታ አምጪ ፈንገሶችን ወይም ኦማይሴቶችን ለመቆጣጠር ተጨማሪ ተዋጽኦዎችን ሊያቀርብ ይችላል።
የኡርቤኖኒክ አሲድ እና ተዋጽኦዎቹ ልዩ ባህሪያት እንደ አረም ማጥፊያዎች እና እንደ የምርምር መሳሪያዎች ለእድገታቸው ጠቃሚ ናቸው። የሳይቶስክሌተን የእፅዋት ሴል ቅርፅን በመቆጣጠር ረገድ ያለው ጠቀሜታ በሰፊው ይታወቃል። ቀደም ሲል የተደረጉ ጥናቶች እንደሚያሳዩት ተክሎች ማይክሮቱቡል ተለዋዋጭነትን በመቆጣጠር ሞርፎጄኔሲስን በአግባቡ ለመቆጣጠር ውስብስብ የኮርቲካል ማይክሮቱቡል አደረጃጀት ዘዴዎችን እንዳዳበሩ አሳይተዋል። የማይክሮቱቡል እንቅስቃሴን ለመቆጣጠር ኃላፊነት ያላቸው በርካታ ሞለኪውሎች ተለይተዋል፣ እና ተዛማጅ ምርምር አሁንም ቀጥሏል3,4,28። በእፅዋት ሴሎች ውስጥ ስላለው የማይክሮቱቡል ተለዋዋጭነት ያለን የአሁኑ ግንዛቤ የኮርቲካል ማይክሮቱቡል አደረጃጀት ዘዴዎችን ሙሉ በሙሉ አያብራራም። ለምሳሌ፣ ሁለቱም ዲሶፒራሚድ እና ኦሪዛሊን ማይክሮቱቡሎችን ዲፖሊመሪዝ ማድረግ ቢችሉም፣ ዲሶፒራሚድ ከባድ የስር መዛባት ያስከትላል፣ ኦሪዛሊን ደግሞ በአንጻራዊ ሁኔታ መለስተኛ ውጤት አለው። ከዚህም በላይ ማይክሮቱቡሎችን የሚያረጋጋው በቱቡሊን ውስጥ ያሉ ሚውቴሽን በስሮች ውስጥ ዴክስትሮሮቴሽንንም ያስከትላል፣ ማይክሮቱቡል ተለዋዋጭነትን የሚያረጋጋው ፓክሊታክስል ግን አያደርግም። ስለዚህ የኡርሶሊክ አሲድ ሞለኪውላዊ ኢላማዎችን ማጥናት እና መለየት በእፅዋት ኮርቲካል ማይክሮቱቡሎች ቁጥጥር ላይ አዲስ ግንዛቤዎችን መስጠት አለበት። በተመሳሳይ፣ እንደ ዳይሶፒራሚድ ያሉ የተዛባ እድገትን ለማበረታታት ውጤታማ የሆኑ ኬሚካሎችን እና እንደ ኦሪዛሊን ወይም ኩማሞቶሪክ አሲድ ያሉ ብዙም ውጤታማ ያልሆኑ ኬሚካሎችን ወደፊት ማወዳደር የተዛባ እድገት እንዴት እንደሚከሰት ፍንጭ ይሰጣል።
በሌላ በኩል ደግሞ፣ ከመከላከያ ጋር የተያያዙ የሳይቶስኬል ዳግም ማስተካከያዎች የኡርሶኒክ አሲድ ሳይቶቶክሲክነትን ለማስረዳት ሌላ አማራጭ ናቸው። በሽታ አምጪ ተህዋሲያን መበከል ወይም ወደ ተክሎች ሴሎች ውስጥ የሚያስገባ ኢንፍላሜሽን አንዳንድ ጊዜ የሳይቶስኬልተንን መጥፋት እና ቀጣይ የሴል ሞትን ያስከትላል29። ለምሳሌ፣ ከ KAND ህክምና ጋር ከሚከሰተው ጋር ተመሳሳይ በሆነ መልኩ ከኦማይሴቴ የተገኘው ክሪፕቶክሳንቲን ከትምባሆ ሴል ሞት በፊት ማይክሮቱቡሎችን እና የአክቲን ክሮች እንደሚያስተጓጉል ተዘግቧል30,31። በመከላከያ ምላሾች እና በኡርሶኒክ አሲድ የሚመነጩ የሴሉላር ምላሾች መካከል ያለው ተመሳሳይነት የተለመዱ የሴሉላር ሂደቶችን እንደሚያስነሳ እንድንገምት አድርጎናል፣ ምንም እንኳን ከክሪፕቶክሳንቲን የበለጠ ፈጣን እና ጠንካራ የዩርሶኒክ አሲድ ተጽእኖ በግልጽ የሚታይ ቢሆንም። ሆኖም፣ ጥናቶች እንደሚያሳዩት የአክቲን ክሮች መስተጓጎል ድንገተኛ የሴል ሞትን ያበረታታል፣ ይህም ሁልጊዜ በማይክሮቱቡል መስተጓጎል አብሮ የማይሄድ29 ነው። በተጨማሪም፣ በሽታ አምጪ ተህዋሲያን ወይም ኢንፍላሜተር የተዛባ የስር እድገትን እንደሚያመጣ መታየት አለበት። ስለዚህ፣ የመከላከያ ምላሾችን እና ሳይቶስኬልን የሚያገናኘው ሞለኪውላዊ እውቀት መፍትሄ ሊሰጠው የሚገባ ማራኪ ችግር ነው። ከዩርሶኒክ አሲድ ጋር የተያያዙ ዝቅተኛ ሞለኪውላዊ ክብደት ውህዶችን እንዲሁም የተለያዩ አቅም ያላቸውን ተዋጽኦዎች በመጠቀም፣ የማይታወቁ የሴሉላር ዘዴዎችን ኢላማ ለማድረግ እድሎችን ሊሰጡ ይችላሉ።
አንድ ላይ ተዳምሮ የማይክሮቱቡል ተለዋዋጭነትን የሚያስተካክሉ አዳዲስ ውህዶችን ማግኘት እና መተግበር የእፅዋት ሴል ቅርፅን ለመወሰን የሚረዱ ውስብስብ ሞለኪውላዊ ዘዴዎችን ለመፍታት ኃይለኛ ዘዴዎችን ይሰጣል። በዚህ አውድ፣ በቅርብ ጊዜ የተፈጠረው ውህድ ኡርሞቶኒክ አሲድ፣ ማይክሮቱቡሎችን እና አክቲን ክሮች ላይ ተጽዕኖ የሚያሳድር እና የሕዋስ ሞትን የሚያመጣው፣ በማይክሮቱቡል ቁጥጥር እና በእነዚህ ሌሎች ዘዴዎች መካከል ያለውን ግንኙነት ለመረዳት እድል ሊሰጥ ይችላል። ስለዚህ፣ ኡርቤኖኒክ አሲድን በመጠቀም የኬሚካል እና የባዮሎጂካል ትንተና የእፅዋት ሳይቶስኬሌተንን የሚቆጣጠሩ ሞለኪውላዊ የቁጥጥር ዘዴዎችን ለመረዳት ይረዳናል።
ኤስ. ዌርራኤንሲስ MK493-CF1ን በ500 ሚሊ ሊትር የተበሳጨ የኤርለንሜየር ጠርሙስ ውስጥ 2% (ወ/ቪ) ጋላክቶስ፣ 2% (ወ/ቪ) የኤሰንስ ፓስታ፣ 1% (ወ/ቪ) የባክቶ ቅንብር። -ሶይተን (ቴርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ፣ ኢንክ.)፣ 0.5% (ወ/ቪ) የበቆሎ ማውጣት (KOGOSTCH Co., Ltd.፣ ጃፓን)፣ 0.2% (ወ/ቪ) (NH4)2SO4 እና 0.2% CaCO3 በዲኦአኖይድድ ውሃ ውስጥ። (ከመምከን በፊት ፒኤች 7.4)። የዘር ባህሎቹ በ27°ሴ ለ2 ቀናት በሮታሪ ሻከር (180 rpm) ላይ ተክለዋል። በጠንካራ ሁኔታ መፍላት አማካኝነት የምርት እርሻ። የዘር ሰብሉ (7 ሚሊ ሊትር) 40 ግራም የምርት መካከለኛ 15 ግራም የተጨመቀ ገብስ (MUSO Co., Ltd., Japan) እና 25 ግራም የተወገደ ውሃ (ከማምከን በፊት ፒኤች አልተስተካከለም) የያዘ 500 ሚሊ ሊትር K-1 ጠርሙስ ውስጥ ተላልፏል። ማፍላቱ በ30°ሴ በጨለማ ውስጥ ለ14 ቀናት ተከናውኗል። የማፍላቱ ቁሳቁስ በ40 ሚሊ ሊትር/ጠርሙስ EtOH እና በሴንትሪፉጅ (1500 ግራም፣ 4°ሴ፣ 10 ደቂቃ) ተወግዷል። የባህል ሱፐርናታንት (60 ሚሊ ሊትር) በ10% MeOH/EtOAc ድብልቅ ተወግዷል። ኦርጋኒክ ንብርብር በተቀነሰ ግፊት ተተንቶ ቅሪት (59.5 ሚ.ግ) ለማግኘት ተችሏል፣ ይህም በተገላቢጦሽ ደረጃ አምድ (SHICEIDO CAPCELL PAK C18 UG120፣ 5 μm፣ ID 10 ሚሜ × ርዝመት 250 ሚሜ) ላይ በ HPLC የግራዲየንት ማስወገጃ (0–10 ደቂቃዎች፡ 90%) ተጋልጧል (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120፣ 5 μm፣ ID 10 ሚሜ × ርዝመት 250 ሚሜ) H2O/CH3CN፣ 10–35 ደቂቃዎች፡ 90% H2O/CH3CN እስከ 70% H2O/CH3CN (ግራዲየንት)፣ 35–45 ደቂቃዎች፡ 90% H2O/EtOH፣ 45–155 ደቂቃዎች፡ 90% H2O/EtOH እስከ 100% EtOH (ግራዲየንት (ግራዲየንት)፣ 155–200 ደቂቃ፡ 100% EtOH) በ1.5 ሚሊ ሊትር/ደቂቃ የፍሰት መጠን፣ coumamonamide (1፣ 36.0 ሚ.ግ) እንደ ነጭ አሞርፎስ ዱቄት ተለይቷል።
ኩማሞቶአሚድ(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ የተሰላ እሴት: 141.0659፣ የተለካ እሴት: 141.0663፣ IR νmax 3451፣ 3414፣ 3173፣ 2938፣ 1603፣ 1593፣ 1537 ሴሜ–1።
የኮሎምቢያ ዘሮች (Col-0) ከ አረብቢዶፕሲስ ባዮሎጂካል ሪሶርስ ሴንተር (ABRC) ለምርምር አገልግሎት ፈቃድ አግኝተው ተገኝተዋል። የኮል-0 ዘሮች በላብራቶሪ ሁኔታችን ስር ተባዝተው እና ተጠብቀው እንደ የዱር አይነት የአረብቢዶፕሲስ ተክሎች ጥቅም ላይ ውለዋል። የአረብቢዶፕሲስ ዘሮች 2% ሱክሮስ (ፉጂፊልም ዋኮ ንፁህ ኬሚካል)፣ 0.05% (w/v) 2-(4-ሞርፎሊኖ) ኢታኔሰልፎኒክ አሲድ (MES) (ፉጂፊልም ዋኮ ንፁህ ኬሚካል) እና 1.5% አጋር (ፉጂፊልም ዋኮ ንፁህ ኬሚካል)፣ pH 5.7፣ በ23°ሴ እና በቋሚ ብርሃን ተገኝተዋል። የphs1-1 ሚውቴሽን ዘሮች የተሰጡት በቲ. ሃሺሞቶ (ናራ የሳይንስ እና ቴክኖሎጂ ተቋም) ነው።
የዝርያ SR-1 ዘሮች በቲ. ሃሺሞቶ (የናራ የሳይንስ እና ቴክኖሎጂ ተቋም) የቀረቡ ሲሆን እንደ የዱር ዓይነት የትምባሆ ተክሎች ጥቅም ላይ ውለዋል። የትምባሆ ዘሮች ለሶስት ሌሊት በንፁህ ውሃ ውስጥ ተወግደው እንዲበቅሉ ተደርገዋል፣ ከዚያም 2% ሱክሮስ፣ 0.05% (w/v) MES እና 0.8% ጄላን ሙጫ (ፉጂፊልም ዋኮ ንፁህ ኬሚካል) ሙራሺጌ እና ስኩግ መካከለኛ) በፒኤች 5.7 ባለው ግማሽ ጥንካሬ ባለው መፍትሄ ውስጥ ይቀመጣሉ እና በቋሚ ብርሃን በ23°ሴ እንዲታቀፉ ተደርገዋል።
የስትራይን ታክ-1 የቀረበው በቲ. ኮህቺ (ኪዮቶ ዩኒቨርሲቲ) ሲሆን ለሊቨርዎርት ጥናት እንደ መደበኛ የሙከራ ክፍል ሆኖ አገልግሏል። ጌማ የተገኘው ከተጸዳዱ የበለፀጉ ተክሎች ሲሆን ከዚያም 1% ሱክሮስ እና 0.3% ጄላን ማስቲካ የያዘውን ጋምቦርግ ቢ5 መካከለኛ (ፉጂፊልም ዋኮ ንፁህ ኬሚካል) ላይ ተሸፍኖ በተከታታይ ብርሃን በ23°ሴ እንዲቆይ ተደርጓል።
የትምባሆ BY-2 ሴሎች (ኒኮቲያና ታባኩም ኤል. ሲቪ. ብሩህ ቢጫ 2) በኤስ. ሃዜዛዋ (የቶኪዮ ዩኒቨርሲቲ) ቀርበዋል። BY-2 ሴሎች በተሻሻለው የሊንስሜየር እና የስኩግ መካከለኛ ውስጥ 95 እጥፍ ተቀልጠው በየሳምንቱ በ2,4-ዲክሎሮፌኖክሲአሴቲክ አሲድ 32 ተጨምረዋል። ​​የሴል እገዳው በ130 rpm በጨለማ ውስጥ በ27°ሴ በ rotary shaker ላይ ተቀላቅሏል። ሴሎችን 10 እጥፍ ትኩስ መካከለኛ መጠን ባለው መጠን ያጠቡ እና በተመሳሳይ መካከለኛ ውስጥ እንደገና ያራግፉ። የማይክሮቱቡል ምልክት ማድረጊያ TagRFP-TUA6ን ወይም የአክቲን ፋይመንት ምልክት ማድረጊያ GFP-ABD2ን በካውቸር ሞዛይክ ቫይረስ 35S ፕሮሞተር ስር በተረጋጋ ሁኔታ የሚገልጹ BY-2 ትራንስጀኒክ የሴል መስመሮች እንደተገለፀው 33,34,35 ተፈጥረዋል። እነዚህ የሴል መስመሮች ከመጀመሪያው BY-2 የሴል መስመር ጋር ተመሳሳይ በሆኑ ሂደቶች ሊጠበቁ እና ሊመሳሰሉ ይችላሉ።
የሄላ ሴሎች በዱልቤኮ የተሻሻለው የኢግልስ መካከለኛ (DMEM) (የሕይወት ቴክኖሎጂዎች) ውስጥ በ10% የፅንስ የከብት ሴረም፣ 1.2 U/ml ፔኒሲሊን እና 1.2 μg/ml ስትሬፕቶማይሲን በ37°ሴ ኢንኩቤተር ውስጥ 5% CO2 ባለው ተጨምሮ ተክለዋል።
በዚህ ጽሑፍ ውስጥ የተገለጹት ሁሉም ሙከራዎች የተከናወኑት በጃፓን የባዮደህንነት ደንቦች እና መመሪያዎች መሠረት ነው።
ውህዶች በዲሜቲል ሰልፎክሳይድ (DMSO፤ Fujifilm Wako Pure Chemical) እንደ ክምችት መፍትሄዎች ተሟጠዋል እና ለአልቢዶፕሲስ እና ለትምባሆ ወይም ለሊቨርዎርት ጋምቦርግ B5 መካከለኛ በኤምኤስ መካከለኛ ውስጥ ተቀላቅለዋል። ለስር እድገት መከላከያ ምርመራ፣ በአንድ ሳህን ከ10 በላይ ዘሮች የተጠቆሙትን ውህዶች ወይም DMSO በያዘው አጋር መካከለኛ ላይ ተዘርተዋል። ዘሮች ለ7 ቀናት በእድገት ክፍል ውስጥ ተቆፍረዋል። ችግኞቹ ፎቶግራፍ ተቀርጸው የሥሮቹ ርዝመት ተለክቷል። ለአረብዶፕሲስ የመራባት ምርመራ፣ በአንድ ሳህን 48 ዘሮች 200 μM ውህድ ወይም DMSO በያዘ አጋር መካከለኛ ላይ ተዘርተዋል። የአረብዶፕሲስ ዘሮች በእድገት ክፍል ውስጥ ተበቅለዋል እና የበቀሉ ችግኞች ብዛት ከተበቀሉ በኋላ ከ7 ቀናት በኋላ ተቆጥሯል። ለትምባሆ የመራባት ምርመራ፣ በአንድ ሳህን 24 ዘሮች 200 μM KAND ወይም DMSO በያዘ አጋር መካከለኛ ላይ ተዘርተዋል። የትምባሆ ዘሮች በእድገት ክፍል ውስጥ ተበቅለዋል እና የበቀሉ ችግኞች ብዛት ከ14 ቀናት በኋላ ተቆጥሯል። ለሊቨርዎርት የእድገት መከላከያ ምርመራ፣ ከእያንዳንዱ ሳህን የተገኙ 9 ሽሎች የተጠቆመውን የ KAND ወይም DMSO ክምችት በያዘ በአጋር መካከለኛ ላይ ተለጥፈው ለ14 ቀናት በእድገት ክፍል ውስጥ እንዲቆዩ ተደርገዋል።
የስር ሜሪስቴም አደረጃጀትን በዓይነ ሕሊናህ ለመሳል በ5 ሚ.ግ/ሚሊ ፕሮፒዲየም አዮዳይድ (PI) የተነከሩ ችግኞችን ተጠቀም። የPI ምልክቶች በቲሲኤስ ኤስፒኢ ኮንፎካል ሌዘር ስካን ማይክሮስኮፕ (ሊካ ማይክሮሲስተም) በመጠቀም በፍሎረሰንስ ማይክሮስኮፒ ታይተዋል።
በማላሚ እና ቤንፌይ36 በተገለጸው ፕሮቶኮል መሠረት የቤታ-ግሉኩሮኒዳዝ (GUS) ሥሮችን ሂስቶኬሚካላዊ ቀለም መቀባት ተከናውኗል። ችግኞቹ በአንድ ሌሊት በ90% አሴቶን ውስጥ ተስተካክለው በGUS ቋት ውስጥ ለ1 ሰዓት በ0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic አሲድ ተቀባ እና በውሃ በተሞላ ክሎራይድ መፍትሄ ውስጥ ተቀምጠዋል። (8 ግራም ክሎራል ሃይድሬት፣ 2 ሚሊ ሊትር ውሃ እና 1 ሚሊ ሊትር ግሊሰሮል) እና በዲፈረንሻል ጣልቃ ገብነት ንፅፅር ማይክሮስኮፒ በአክሲዮ ኢሜጀር M1 ማይክሮስኮፕ (ካርል ዜይስ) በመጠቀም ተመልክተዋል።
የስር ማዕዘኖች የተለኩት በአቀባዊ በተቀመጡ ሳህኖች ላይ በሚበቅሉ የ7 ቀን ችግኞች ላይ ነው። የስር ማዕዘኑን በደረጃ 6 እንደተገለጸው ከስበት ቬክተር አቅጣጫ ይለኩ።
የኮርቲካል ማይክሮቱቡሎች አደረጃጀት እንደተገለጸው ታይቷል፣ በፕሮቶኮል 37 ላይ ጥቃቅን ማሻሻያዎችን በማድረግ። ፀረ-β-ቱቡሊን ፀረ እንግዳ አካል (KMX-1፣ Merk Millipore: MAB3408) እና አሌክሳ ፍሎር 488-የተያያዘ ፀረ-አይጥ IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) በቅደም ተከተል እንደ ዋና እና ሁለተኛ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካላት በ1:1000 እና 1:100 ዲሉሽንስ ጥቅም ላይ ውለዋል። የፍሎረሰንስ ምስሎች የተገኙት በTCS SPE ኮንፎካል ሌዘር ቅኝት ማይክሮስኮፕ (Leica Microsystems) በመጠቀም ነው። የZ-stack ምስሎችን ያግኙ እና በአምራቹ መመሪያ መሰረት ከፍተኛውን የጥንካሬ ትንበያ ይፍጠሩ።
የሄላ ሴል ፕሮስቴት ምርመራ የተካሄደው በአምራቹ መመሪያ መሰረት የሴል ቆጠራ ኪት 8 (ዶጂንዶ) በመጠቀም ነው።
የኢ. ኮላይ DH5α እድገት በባህል ውስጥ ያለውን የሴል ጥግግት በ600 nm (OD600) በመጠቀም በስፔክትሮፎቶሜትር በመለካት ተተነተነ።
በትራንስጀኒክ BY-2 ሴሎች ውስጥ የሳይቶስኬል አደረጃጀት የታየበት ምክንያት የCSU-X1 ኮንፎካል ቅኝት መሳሪያ (ዮኮጋዋ) እና የsCMOS ካሜራ (ዚላ፣ አንዶር ቴክኖሎጂ) የተገጠመለት የፍሎረሰንስ ማይክሮስኮፕ በመጠቀም ነው። የሳይቶስኬል ጥግግት በምስል ትንተና ተገምግሟል፣ ይህም በምስል ትንተና እንደተገለፀው ImageJ ሶፍትዌርን በመጠቀም በኮንፎካል ምስሎች ውስጥ በሳይቶፕላዝሚክ ፒክስሎች መካከል ያለውን የሳይቶስኬል ፒክስሎች መቶኛ መጠን አስልቷል።
በBY-2 ሴሎች ውስጥ የሕዋስ ሞትን ለመለየት፣ የሕዋስ እገዳው አንድ ክፍል በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ10 ደቂቃዎች በ0.05% ኢቫንስ ሰማያዊ ቀለም ተቀባ። የሞቱ ሴሎችን የሚመርጥ የኢቫንስ ሰማያዊ ቀለም በተጠበቀው የፕላዝማ ሽፋን40 አማካኝነት ከሚኖሩ ሴሎች የሚወጣውን ቀለም በመለየት ላይ የተመሠረተ ነው። የተበከሉ ሴሎች ደማቅ መስክ ማይክሮስኮፕ (BX53፣ ኦሊምፐስ) በመጠቀም ታይተዋል።
የሄላ ሴሎች በዲኤምኢኤም ውስጥ በ37°ሴ እና 5% CO2 እርጥበት ባለው ኢንኩቤተር ውስጥ በ10% FBS ተጨምረው ይበቅላሉ። ሴሎች በ100 μM KAND 11፣ ኩማሞናሚክ አሲድ 6፣ ኩማሞናሚድ 1፣ 100 ng/ml ኮልሴሚድ (ጊብኮ) ወይም በ100 ng/ml ኖኮድማዜ (ሲግማ) ለ6 ሰዓታት በ37°ሴ ታክመዋል። ሴሎች በሜትኦኤች ለ10 ደቂቃ እና ከዚያም በክፍል ሙቀት ለ5 ደቂቃ በአሲቴት ተስተካክለዋል። ቋሚ ሴሎች በβ-ቱቡሊን ፕራይመሪ አንቲቦዲ (1D4A4፣ Proteintech: 66240-1) በ0.5% BSA/PBS ለ2 ሰዓታት ተቀላቅለው፣ በTBST 3 ጊዜ ታጥበው ከዚያም በአሌክሳ ፍሎር ፍየል አንቲቦዲ ታክመዋል። 488 ለ1 ሰዓት። – የመዳፊት IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) እና 15 ng/ml 4′፣ 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) በ0.5% BSA/PBS ተበርዟል። በTBST ሶስት ጊዜ ከታጠቡ በኋላ፣ በNikon Eclipse Ti-E በተገለበጠ ማይክሮስኮፕ ላይ የቆሸሹ ሴሎች ታይተዋል። ምስሎቹ የMetaMorph ሶፍትዌር (ሞለኪውላር መሳሪያዎች) በመጠቀም በቀዝቃዛው Hamamatsu ORCA-R2 CCD ካሜራ ተቀርጸዋል።