ተኩስ አፒካል ሜሪስተም (SAM) እድገት ለግንድ አርክቴክቸር ወሳኝ ነው። የእፅዋት ሆርሞኖችጊቤሬሊንስ(GAs) የእፅዋትን እድገት በማስተባበር ቁልፍ ሚናዎችን ይጫወታሉ፣ ነገር ግን በSAM ውስጥ ያላቸው ሚና በደንብ አልተረዳም። እዚህ፣ በGA ዕውቅና ላይ ያለውን ውድመት በመጠበቅ በGA ግልባጭ ምላሽ ውስጥ ያለውን አስፈላጊ የቁጥጥር ተግባር ለመጨቆን በዲኤልኤ ፕሮቲን ምህንድስና የ GA ምልክት ሬቲሜትሪክ ባዮሴንሰር አዘጋጅተናል። ይህ በመበላሸቱ ላይ የተመሰረተ ባዮሴንሰር በእድገት ወቅት በGA ደረጃዎች እና በሴሉላር ዳሳሾች ላይ የተደረጉ ለውጦችን በትክክል እንደሚመዘግብ እናሳያለን። ይህንን ባዮሴንሰር በSAM ውስጥ የGA ምልክት ማድረጊያ እንቅስቃሴን ለመቅረጽ ተጠቀምን። ከፍተኛ የጂኤ ሲግናሎች በብዛት የሚገኙት በኦርጋን ፕሪሞርዲያ መካከል በሚገኙ ሴሎች ውስጥ ሲሆን ይህም ለኢንተርኖድ ሴሎች ቀድመው እንደሚገኙ እናሳያለን። የትርፍ እና የተግባር ማጣት አቀራረቦችን በመጠቀም፣ GA የሕዋስ ዲቪዚዮን አውሮፕላን አቅጣጫን እንደሚቆጣጠር፣ የኢንተርኖዶች ቀኖናዊ ሴሉላር አደረጃጀት በማቋቋም፣ በSAM ውስጥ የኢንተርኖድ ዝርዝር መግለጫን እንደሚያሳድግ የበለጠ እናሳያለን።
ተኩሱ አፒካል ሜሪስቴም (SAM)፣ በተኩሱ ጫፍ ላይ የሚገኘው፣ ተክሉ በሚቆይበት ጊዜ ሁሉ እንቅስቃሴው የጎን አካላትን እና ግንድ ኖዶችን በሞዱል እና በተደጋገመ መልኩ የሚያመነጭ የሴል ሴሎችን ይዟል። እነዚህ እያንዳንዳቸው የሚደጋገሙ አሃዶች ወይም የእጽዋት ኖዶች በኖዶች ውስጥ ኢንተርኖዶች እና የጎን አካላትን እና በቅጠሎቹ axils ውስጥ ያሉ አክሰል ሜሪስቴምስን ያጠቃልላል። በእድገት ወቅት የእጽዋት አንጓዎች እድገትና አደረጃጀት ይለወጣል. በአረቢዶፕሲስ ውስጥ በእጽዋት ደረጃ ውስጥ የኢንተርኖዶል እድገቶች ይጨቆናሉ, እና axillary meristems በሮዝት ቅጠሎች ዘንጎች ውስጥ ይተኛሉ. ወደ የአበባው ክፍል በሚሸጋገርበት ጊዜ SAM የበቀለው ሜሪስቴም ይሆናል, ረዣዥም internodes እና axillary ቡቃያዎችን, ቅርንጫፎችን በ cauline ቅጠሎች axils, እና በኋላ, ቅጠል የሌላቸው አበቦች2. ምንም እንኳን ቅጠሎችን, አበቦችን እና ቅርንጫፎችን አጀማመርን የሚቆጣጠሩትን ዘዴዎች በመረዳት ረገድ ከፍተኛ እድገት ቢያደርግም, ኢንተርኖዶች እንዴት እንደሚፈጠሩ ግን ብዙም አይታወቅም.
የጂኤኤስ የቦታ ስርጭትን መረዳቱ የእነዚህን ሆርሞኖች ተግባራት በተለያዩ ቲሹዎች እና በተለያዩ የእድገት ደረጃዎች ውስጥ በተሻለ ሁኔታ ለመረዳት ይረዳል. በራሱ አራማጅ ድርጊት የተገለጸውን የRGA-GFP ውህደትን መበላሸት ማየት በ roots15,16 ውስጥ ስላለው አጠቃላይ የGA ደረጃዎች ቁጥጥር ጠቃሚ መረጃ ይሰጣል። ነገር ግን፣ የ RGA አገላለጽ በቲሹዎች17 ይለያያል እና በ GA18 ቁጥጥር ይደረግበታል። ስለዚህ የ RGA አራማጅ ልዩነት አገላለጽ በ RGA-GFP ላይ የሚታየውን የፍሎረሰንት ንድፍ ሊያስከትል ስለሚችል ይህ ዘዴ መጠናዊ አይደለም. በቅርብ ጊዜ፣ ባዮአክቲቭ ፍሎረሴይን (ኤፍኤል) የተለጠፈው GA19,20 የ GA ክምችት ስርወ endocortex ውስጥ መከማቸቱን እና የሴሉላር ደረጃውን በ GA ትራንስፖርት እንደሚቆጣጠር አሳይቷል። በቅርብ ጊዜ፣ የGA FRET ዳሳሽ nlsGPS1 እንደሚያሳየው የGA ደረጃዎች ከሥሮች፣ ክሮች እና ጥቁር-ያደገ hypocotyls21 የሕዋስ ማራዘሚያ ጋር ይዛመዳሉ። ነገር ግን፣ እንደተመለከትነው፣ የGA ምልክት እንቅስቃሴን የሚቆጣጠረው የGA ትኩረት ብቻ አይደለም፣ ምክንያቱም ውስብስብ በሆነ የዳሰሳ ሂደት ላይ የተመሰረተ ነው። እዚህ፣ ስለ DELLA እና GA ምልክት ማድረጊያ መንገዶች ያለንን ግንዛቤ በማዳበር፣ በመበላሸት ላይ የተመሰረተ ሬቲሜትሪክ ባዮሴንሰር ለ GA ምልክት ማዳበሩን እና ባህሪን ሪፖርት እናደርጋለን። ይህን መጠናዊ ባዮሴንሰርን ለማዳበር ከፍሎረሰንት ፕሮቲን ጋር የተዋሃደ እና በሁሉም ቦታ በቲሹዎች ውስጥ የሚገለፅ ሚውቴሽን GA-sensitive RGA ተጠቀምን። የ mutant RGA ፕሮቲን ውህዶች በየቦታው ሲገለጹ ውስጣዊ የ GA ምልክት ላይ ጣልቃ እንደማይገቡ እና ይህ ባዮሴንሰር በሁለቱም የGA ግብዓት እና የ GA ሲግናል ሂደት የሚገኘውን የምልክት እንቅስቃሴን በከፍተኛ የቦታ መፍታት ሊለካ እንደሚችል እናሳያለን። ይህንን ባዮሴንሰር የGA ምልክት ማድረጊያ እንቅስቃሴን የቦታ ስርጭትን ለመለካት እና GA በSAM epidermis ውስጥ ያለውን ሴሉላር ባህሪ እንዴት እንደሚቆጣጠር ለመለካት ተጠቀምን። GA በ organ primordia መካከል የሚገኙትን የ SAM ሴሎች ክፍፍል አውሮፕላን አቅጣጫ እንደሚቆጣጠር እናሳያለን ፣ በዚህም የኢንተርኖድ ቀኖናዊ ሴሉላር አደረጃጀትን ይገልፃል።
በመጨረሻም፣qmRGA በማደግ ላይ ያሉ ሃይፖኮቲሎችን በመጠቀም ውስጣዊ የGA ደረጃዎች ላይ ለውጦችን ሪፖርት ማድረግ ይችል እንደሆነ ጠየቅን። ቀደም ሲል ናይትሬት የ GA ውህድነትን በማሳደግ እድገትን እንደሚያበረታታ እና በተራው ደግሞ DELLA34 መበላሸትን አሳይተናል። በዚህም መሰረት፣ በ pUBQ10::qmRGA ውስጥ በብዛት ናይትሬት አቅርቦት (10 mM NO3−) የሚበቅሉት ችግኞች በናይትሬት ጉድለት ስር ከሚበቅሉት ችግኞች (ተጨማሪ ምስል 6 ሀ) ውስጥ ያለው የhypocotyl ርዝመት በከፍተኛ ደረጃ እንደሚረዝም ተመልክተናል። ከእድገት ምላሹ ጋር በሚስማማ መልኩ የጂኤ ምልክቶች ናይትሬት በሌለበት ከሚበቅሉት ችግኞች ይልቅ በ10 ሚሜ NO3- ሁኔታ ከሚበቅሉ ችግኞች hypocotyls ከፍ ያለ ነበር (ተጨማሪ ምስል 6 ለ፣ ሐ)። ስለዚህ፣qmRGA በተጨማሪም በ GA ትኩረት ውስጥ ባሉ ውስጣዊ ለውጦች የተከሰቱ የGA ምልክት ለውጦችን መከታተል ያስችላል።
በqmRGA የተገኘው የGA ምልክት እንቅስቃሴ በGA ትኩረት እና በ GA ግንዛቤ ላይ የተመረኮዘ መሆኑን ለመረዳት በሴንሰሩ ዲዛይን ላይ በመመስረት እንደተጠበቀው የሶስቱን የጂአይዲ1 ተቀባዮች በእፅዋት እና በመራቢያ ቲሹዎች ውስጥ ያለውን መግለጫ ተንትነናል። በችግኝት ውስጥ፣ የጂአይዲ1-GUS ዘጋቢ መስመር GID1a እና c በኮቲሌዶን (ምስል 3a-c) ውስጥ በጣም ተገልጸዋል። በተጨማሪም ሦስቱም ተቀባይ በቅጠሎች፣ በላተራል ሥር ፕሪሞርዲያ፣ ሥሩ ምክሮች (ከ GID1b ሥር ካፕ በስተቀር) እና በሥርዓተ-ወሳጅ ሥርዓት (ምስል 3a-c) ተገልጸዋል። በ inflorescence SAM ውስጥ፣ የ GUS ምልክቶችን ለጂአይዲ1b እና 1c ብቻ አግኝተናል (ተጨማሪ ምስል 7a-c)። በቦታው ላይ ማዳቀል እነዚህን የቃላት አገላለጾች አረጋግጧል እና GID1c በSAM ውስጥ በዝቅተኛ ደረጃዎች ተመሳሳይ በሆነ መልኩ መገለጹን አሳይቷል፣ GID1b ግን በSAM ዙሪያ ከፍ ያለ አገላለጽ አሳይቷል (ተጨማሪ ምስል 7d-l)። የpGID1b:: 2xmTQ2-GID1b የትርጉም ውህደት ደረጃ የተሰጠው የጂአይዲ1ቢ አገላለጽ መጠን፣ በSAM መሃል ላይ ከዝቅተኛ ወይም ምንም አገላለጽ እስከ ከፍተኛ የአካል ድንበሮች (ተጨማሪ ምስል 7 ሜትር) አሳይቷል። ስለዚህ የጂአይዲ1 ተቀባዮች በቲሹዎች እና በቲሹዎች ውስጥ አንድ ወጥ በሆነ መልኩ አልተሰራጩም። በቀጣዮቹ ሙከራዎች ደግሞ የጂአይዲ1 (pUBQ10:: GID1a-mCherry) ከመጠን በላይ መጨመር የqmRGA በ hypocotyls ውስጥ ለውጫዊ GA መተግበሪያ (ምስል 3d, e) ያለውን ስሜት ከፍ እንደሚያደርግ ተመልክተናል። በአንጻሩ፣ በሃይፖኮቲል ውስጥ በqd17mRGA የሚለካው ፍሎረሴንስ ለGA3 ሕክምና ግድ የለሽ ነበር (ምስል 3f፣ g)። ለሁለቱም ምርመራዎች፣ የጂአይዲ1 ተቀባይ ጋር የማገናኘት ችሎታ የተሻሻለ ወይም የጠፋበትን የሴንሰሩን ፈጣን ባህሪ ለመገምገም ችግኞች በከፍተኛ የ GA (100 μM GA3) ከፍተኛ መጠን ታክመዋል። እነዚህ ውጤቶች አንድ ላይ ሆነው፣qmRGA biosensor እንደ GA እና GA ዳሳሽ ጥምር ተግባር እንደሚያገለግል ያረጋግጣሉ፣ እና የጂአይዲ1 ተቀባይ ልዩነት አገላለጽ የሴንሰሩን ልቀት በከፍተኛ ሁኔታ ማስተካከል እንደሚችል ይጠቁማሉ።
እስከዛሬ፣ በSAM ውስጥ የGA ሲግናሎች ስርጭት ግልጽ አልሆነም። ስለዚህ የጂኤ ምልክት ማድረጊያ እንቅስቃሴ ከፍተኛ ጥራት ያላቸውን የቁጥር ካርታዎች ለማስላት qmRGA-expressing ተክሎች እና pCLV3::mCherry-NLS stem cell reporter35 ተጠቀምን በ L1 ንብርብር ላይ በማተኮር L1 (ኤፒደርሚስ፤ ምስል 4a, b, ዘዴዎችን እና ተጨማሪ ዘዴዎችን ይመልከቱ) SAM 36 በመቆጣጠር ረገድ ቁልፍ ሚና ስለሚጫወት። እዚህ፣ pCLV3::mCherry-NLS አገላለጽ የጂኤ ምልክት ማድረጊያ እንቅስቃሴን የቦታ ስርጭትን ለመተንተን ቋሚ የጂኦሜትሪክ ማመሳከሪያ ነጥብ አቅርቧል። ምንም እንኳን GA ለጎን የአካል ክፍሎች እድገት አስፈላጊ ነው ተብሎ ቢታሰብም የGA ምልክቶች ከፒ 3 ደረጃ ጀምሮ ባሉት የአበባ ፕሪሞርዲየም (P) ዝቅተኛ ሲሆኑ፣ ወጣት P1 እና P2 primordiums ግን በማዕከላዊ ክልል ውስጥ ካለው ጋር ተመሳሳይነት ያለው መጠነኛ እንቅስቃሴ እንዳላቸው አስተውለናል (ምስል 4a, b)። ከፍ ያለ የጂኤ ምልክት እንቅስቃሴ በኦርጋን ፕሪሞርዲየም ድንበሮች ላይ ተገኝቷል፣ ከ P1/P2 ጀምሮ (ከድንበሩ ጎን) እና በፒ 4 ላይ ፣ እንዲሁም በፕሪሞርዲያ መካከል በሚገኙ ሁሉም የፔሪፈርል ክልል ሴሎች ውስጥ (ምስል 4 ሀ ፣ ለ እና ተጨማሪ ምስል 8 ሀ ፣ ለ)። ይህ ከፍተኛ የጂኤ ምልክት እንቅስቃሴ በ epidermis ውስጥ ብቻ ሳይሆን በ L2 እና የላይኛው L3 ንብርብሮች (ተጨማሪ ምስል 8 ለ) ታይቷል. qmRGAን በመጠቀም በSAM ውስጥ የተገኙት የGA ሲግናሎች ንድፍ በጊዜ ሂደት ሳይለወጥ ቆይቷል (ተጨማሪ ምስል 8c–f፣ k)። ምንም እንኳን የqd17mRGA ግንባታ በ SAM of T3 ተክሎች ውስጥ በዝርዝር ከገለጽናቸው አምስት ገለልተኛ መስመሮች ውስጥ ስልታዊ በሆነ መልኩ የተቀነሰ ቢሆንም በpRPS5a::VENUS-2A-TagBFP ግንባታ (ተጨማሪ ምስል 8g-j, l) የተገኘውን የፍሎረሰንስ ንድፎችን ለመተንተን ችለናል። በዚህ የቁጥጥር መስመር፣ በSAM ውስጥ በፍሎረሰንስ ጥምርታ ላይ ያሉ ጥቃቅን ለውጦች ብቻ ተገኝተዋል፣ ነገር ግን በSAM ማእከል ውስጥ ከTagBFP ጋር በተገናኘ የ VENUS ግልጽ እና ያልተጠበቀ ቅናሽ አስተውለናል። ይህ በqmRGA የተስተዋለው የምልክት ማመላከቻ ስርዓተ-ጥለት GA-ጥገኛ mRGA-VENUS መበስበስን እንደሚያንፀባርቅ ያረጋግጣል፣ነገር ግን qmRGA በሜሪስተም ማእከል ውስጥ የGA ምልክት እንቅስቃሴን ከመጠን በላይ ሊገምት እንደሚችል ያሳያል። በማጠቃለያው ውጤታችን የፕሪሞርዲያ ስርጭትን በዋናነት የሚያንፀባርቅ የGA ምልክት ማሳያን ያሳያል። ይህ የኢንተር-ፕሪሞርዲያል ክልል (IPR) ስርጭት በታዳጊው ፕሪሞርዲየም እና በማዕከላዊ ክልል መካከል ያለው ከፍተኛ የ GA ምልክት እንቅስቃሴ ቀስ በቀስ በማቋቋም ሲሆን በተመሳሳይ ጊዜ በፕሪሞርዲየም ውስጥ ያለው የ GA ምልክት እንቅስቃሴ ይቀንሳል (ምስል 4 ሐ, መ).
የጂአይዲ1ብ እና የጂአይዲ1ሲ ተቀባይ ስርጭት (ከላይ ያለውን ይመልከቱ) የGA ተቀባዮች ልዩነት መግለጫ በSAM ውስጥ ያለውን የGA ምልክት እንቅስቃሴ ንድፍ ለመቅረጽ እንደሚረዳ ይጠቁማል። የGA ልዩነት ክምችት ይሳተፋል ወይ ብለን አሰብን። ይህንን ዕድል ለመመርመር፣ nlsGPS1 GA FRET sensor21 ተጠቀምን። የማግበር ድግግሞሽ በ NlsGPS1 በ10 μM GA4+7 ለ100 ደቂቃ መታከም በ SAM ውስጥ ተገኝቷል (ተጨማሪ ምስል 9a–e)፣ ይህም nlsGPS1 በSAM ውስጥ በGA ትኩረት ላይ ለሚደረጉ ለውጦች ምላሽ እንደሚሰጥ፣ በ roots21 እንደሚደረገው ያሳያል። የቦታ ስርጭት nlsGPS1 የማግበር ድግግሞሽ በኤስኤኤም ውጫዊ ንብርብሮች ውስጥ በአንጻራዊ ሁኔታ ዝቅተኛ የ GA ደረጃዎችን አሳይቷል፣ ነገር ግን በማዕከሉ እና በኤስኤምኤም ድንበሮች ላይ ከፍ ያሉ መሆናቸውን አሳይቷል (ምስል 4e እና ተጨማሪ ምስል 9 ሀ ፣ ሐ)። ይህ GA እንዲሁ በqmRGA ከተገለፀው ጋር በሚወዳደር የቦታ ንድፍ በSAM ውስጥ መሰራጨቱን ያሳያል። እንደ ማሟያ አቀራረብ፣ SAMን በፍሎረሰንት GA (GA3-፣ GA4-፣ GA7-Fl) ወይም Fl ብቻውን እንደ አሉታዊ ቁጥጥር አድርገነዋል። የFl ምልክት በSAM ውስጥ ተሰራጭቷል፣ ማዕከላዊ ክልል እና ፕሪሞርዲየምን ጨምሮ፣ ምንም እንኳን በትንሹ ጥንካሬ (ምስል 4j እና ተጨማሪ ምስል 10d)። በአንጻሩ፣ ሦስቱም GA-Fl በተለይ በፕሪሞርዲየም ድንበሮች ውስጥ እና በተቀረው IPR ውስጥ በተለያየ ዲግሪ ተከማችተዋል፣ GA7-Fl በ IPR ውስጥ በትልቁ ጎራ (ምስል 4k እና ተጨማሪ ምስል 10a,b) ይከማቻሉ። የፍሎረሰንስ ጥንካሬን መመዘን የ IPR እና IPR ያልሆነ የጥንካሬ መጠን በGA-Fl-ታከመ SAM ከፍ ያለ መሆኑን ያሳያል Fl-treated SAM (ምስል 4l እና ተጨማሪ ምስል 10c)። እነዚህ ውጤቶች አንድ ላይ ሆነው GA በኦርጋን ድንበር አቅራቢያ በሚገኙ የ IPR ህዋሶች ውስጥ በከፍተኛ መጠን እንደሚገኝ ይጠቁማሉ። ይህ የሚያሳየው የSAM GA ምልክት አመልካች እንቅስቃሴ ከሁለቱም የGA ተቀባይ አገላለጾች እና የጂኤ ልዩነት በ IPR ሕዋሶች ውስጥ በአካል ድንበሮች አቅራቢያ በመከማቸት ነው። ስለዚህ የእኛ ትንተና ያልተጠበቀ የስፔዮቴምፖራል ንድፍ የ GA ምልክት አሳይቷል ፣ በማዕከላዊ እና በ SAM የመጀመሪያ ደረጃ ዝቅተኛ እንቅስቃሴ እና በ IPR ውስጥ በአከባቢው ክልል ውስጥ ከፍተኛ እንቅስቃሴ።
በSAM ውስጥ ያለውን የልዩነት GA ምልክት ማድረጊያ እንቅስቃሴን ሚና ለመረዳት፣ የSAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS የእውነተኛ ጊዜ ጊዜ ያለፈበት ምስል በመጠቀም በ GA ምልክት እንቅስቃሴ፣ የሕዋስ መስፋፋት እና የሕዋስ ክፍፍል መካከል ያለውን ትስስር ተንትነናል። በዕድገት ቁጥጥር ውስጥ የጂኤ ሚናን ከግምት ውስጥ በማስገባት ከሴል ማስፋፊያ መለኪያዎች ጋር አወንታዊ ትስስር ይጠበቃል። ስለዚህ በመጀመሪያ የGA ምልክት እንቅስቃሴ ካርታዎችን ከሴል ወለል እድገት ፍጥነት ካርታዎች ጋር አነጻጽረን (ለሴሎች መስፋፋት ጥንካሬ ለሴሎች እና ለሴት ልጅ ህዋሶች በክፍፍል) እና የእድገት አኒሶትሮፒ ካርታዎች የሕዋስ መስፋፋት አቅጣጫን የሚለካው (እንዲሁም እዚህ ለተጠቀሰው ሕዋስ እና ለሴት ልጅ ክፍሎች በክፍል ውስጥ ጥቅም ላይ ይውላል ፣ ምስል 5 ሀ ፣ ለ ፣ ዘዴዎችን እና ተጨማሪ ዘዴዎችን ይመልከቱ)። የእኛ ካርታዎች የሳም ሴል ወለል ዕድገት ፍጥነት ከቀደምት ምልከታዎች 38,39 ጋር የሚጣጣም ነው, በድንበሩ ላይ አነስተኛ የእድገት ደረጃዎች እና በአበቦች ውስጥ ከፍተኛ የእድገት ደረጃዎች (ምስል 5 ሀ). የዋና ክፍል ትንተና (ፒሲኤ) እንደሚያሳየው የ GA ምልክት ማድረጊያ እንቅስቃሴ ከሴል ወለል እድገት ጥንካሬ ጋር አሉታዊ ትስስር እንዳለው ያሳያል (ምስል 5 ሐ)። እንዲሁም የ GA ምልክት ግብዓት እና የእድገት ጥንካሬን ጨምሮ የልዩነት ዋና ዋናዎቹ ዘንጎች በከፍተኛ የ CLV3 አገላለጽ ከተወሰነው አቅጣጫ ጋር የተዛመደ መሆኑን አሳይተናል ፣ ይህም በቀሪዎቹ ትንታኔዎች ውስጥ ሴሎች ከ SAM ማእከል መገለላቸውን ያረጋግጣል። የስፔርማን ቁርኝት ትንተና የ PCA ውጤቶችን አረጋግጧል (ምስል 5d) ይህም በ IPR ውስጥ ከፍ ያለ የ GA ምልክቶች ከፍተኛ የሕዋስ መስፋፋትን አላመጣም. ነገር ግን፣የግንኙነት ትንተና በጂኤ ምልክት ሰጪ እንቅስቃሴ እና በእድገት anisotropy መካከል ትንሽ አወንታዊ ትስስር አሳይቷል (ምስል 5c፣d)፣ ይህም በ IPR ውስጥ ከፍ ያለ የGA ምልክት በሴል እድገት አቅጣጫ እና ምናልባትም በሴል ክፍፍል አውሮፕላን አቀማመጥ ላይ ተጽዕኖ እንደሚያሳድር ይጠቁማል።
a, b የሙቀት ካርታዎች አማካይ የገጽታ ዕድገት (ሀ) እና የእድገት anisotropy (ለ) በSAM ውስጥ በአማካይ ከሰባት በላይ ገለልተኛ ተክሎች (እንደ ቅደም ተከተላቸው የሕዋስ መስፋፋት ጥንካሬ እና አቅጣጫ እንደ ፕሮክሲዎች ጥቅም ላይ ይውላሉ). c PCA ትንተና የሚከተሉትን ተለዋዋጮች አካትቷል፡ GA ሲግናል፣ የገጽታ ዕድገት ጥንካሬ፣ የገጽታ ዕድገት anisotropy እና CLV3 አገላለጽ። PCA ክፍል 1 በዋነኝነት አሉታዊ በሆነ መልኩ ከገጽታ ዕድገት ጥንካሬ ጋር የተቆራኘ እና በአዎንታዊ መልኩ ከጂኤ ምልክት ጋር የተቆራኘ ነው። PCA ክፍል 2 በዋነኛነት በአዎንታዊ መልኩ ከገጽታ እድገት anisotropy ጋር የተቆራኘ እና ከCLV3 አገላለጽ ጋር በአሉታዊ መልኩ የተዛመደ ነው። መቶኛዎች በእያንዳንዱ አካል የተብራራውን ልዩነት ይወክላሉ። d Spearman ትሰስር ትንተና በ GA ምልክት መካከል, የገጽታ ዕድገት ጥንካሬ, እና የገጽታ እድገት anisotropy CZ ሳይጨምር በቲሹ ሚዛን. በቀኝ በኩል ያለው ቁጥር በሁለት ተለዋዋጮች መካከል ያለው የ Spearman rho እሴት ነው። ኮከቦች የግንኙነት/አሉታዊ ግኑኝነት በጣም ጉልህ የሆነባቸውን ጉዳዮች ያመለክታሉ። ሠ 3D የ Col-0 SAM L1 ሕዋሳት በኮንፎካል ማይክሮስኮፒ እይታ። በ SAM (ግን ፕሪሞርዲየም ሳይሆን) በ 10 ሰአታት ውስጥ የተሰሩ አዲስ የሕዋስ ግድግዳዎች እንደ አንግል እሴታቸው ቀለም አላቸው። የቀለም አሞሌ ከታች በቀኝ ጥግ ላይ ይታያል. ማስገቢያው በ 0 ሰዓት ላይ ያለውን ተዛማጅ 3D ምስል ያሳያል. ሙከራው በተመሳሳይ ውጤት ሁለት ጊዜ ተደግሟል። f የሳጥን ቦታዎች በ IPR እና IPR ያልሆኑ Col-0 SAM (n = 10 ገለልተኛ ተክሎች) የሕዋስ ክፍፍል መጠኖችን ያሳያሉ። የመካከለኛው መስመር መካከለኛውን ያሳያል, እና የሳጥኑ ወሰኖች 25 ኛ እና 75 ኛ መቶኛን ያመለክታሉ. ዊስክ በ R ሶፍትዌር የተወሰነውን አነስተኛ እና ከፍተኛ እሴቶችን ያመለክታሉ። ፒ ዋጋዎች የተገኙት በዌልች ባለ ሁለት ጭራ ቲ-ሙከራ ነው። g፣ h የመርሃግብር ዲያግራም የሚያሳየው (ሰ) የአዲሱን ሕዋስ ግድግዳ (ማጀንታ) አንግል ከሳም መሃል ካለው ራዲያል አቅጣጫ አንፃር እንዴት እንደሚለካ (ነጭ ነጠብጣብ መስመር) (አጣዳፊ አንግል እሴቶች ብቻ ማለትም 0-90 ° ፣ ይታሰባሉ) እና (ሸ) በሜሪዝም ውስጥ ያሉት የክብ/የጎን እና ራዲያል አቅጣጫዎች። i የሴል ዲቪዥን አይሮፕላን አቅጣጫ ድግግሞሽ ሂስቶግራም በኤስኤኤም (ጥቁር ሰማያዊ)፣ IPR (መካከለኛ ሰማያዊ) እና IPR ያልሆኑ (ቀላል ሰማያዊ)። ፒ ዋጋዎች በሁለት ጭራ ኮልሞጎሮቭ-ስሚርኖቭ ሙከራ ተገኝተዋል። ሙከራው በተመሳሳይ ውጤት ሁለት ጊዜ ተደግሟል። j የድግግሞሽ ሂስቶግራም የሴል ዲቪዥን አይሮፕላን አቅጣጫ IPR በP3 ዙሪያ (ቀላል አረንጓዴ) ፣ P4 (መካከለኛ አረንጓዴ) እና P5 (ጥቁር አረንጓዴ) ፣ በቅደም ተከተል። ፒ ዋጋዎች በሁለት ጭራ ኮልሞጎሮቭ-ስሚርኖቭ ሙከራ ተገኝተዋል። ሙከራው በተመሳሳይ ውጤት ሁለት ጊዜ ተደግሟል።
ስለዚህ, በመመርመሪያው ወቅት አዲስ የተገነቡ የሕዋስ ግድግዳዎችን በመለየት በ GA ምልክት እና በሴል ክፍፍል እንቅስቃሴ መካከል ያለውን ግንኙነት መርምረናል (ምስል 5e). ይህ አቀራረብ የሕዋስ ክፍፍልን ድግግሞሽ እና አቅጣጫ ለመለካት አስችሎናል. በሚያስደንቅ ሁኔታ, በ IPR እና በተቀረው SAM (IPR ያልሆኑ, ስእል 5f) ውስጥ ያለው የሴል ክፍፍሎች ድግግሞሽ ተመሳሳይ መሆኑን ደርሰንበታል, ይህም በ IPR እና IPR ባልሆኑ ሴሎች መካከል ያለው የ GA ምልክት ልዩነት የሕዋስ ክፍፍልን በእጅጉ እንደማይጎዳ ያሳያል. ይህ፣ እና በጂኤ ምልክት እና በእድገት anisotropy መካከል ያለው አወንታዊ ትስስር፣ የGA ምልክት ማድረጊያ እንቅስቃሴ የሕዋስ ክፍፍል አውሮፕላን አቅጣጫ ላይ ተጽዕኖ ሊያሳድር እንደሚችል እንድናስብ አነሳሳን። የአዲሱ የሕዋስ ግድግዳ አቅጣጫ የሜሪስቴም ማእከልን እና የአዲሱን የሕዋስ ግድግዳ ማእከል (ምስል 5e-i) የሚያገናኘው ራዲያል ዘንግ ጋር ሲነፃፀር እንደ አጣዳፊ አንግል ለካ እና ሴሎች ከጨረር ዘንግ ጋር ወደ 90 ° ቅርብ በሆነ ማዕዘኖች የመከፋፈል ዝንባሌን ተመልክተናል ከፍተኛ ድግግሞሽ በ 70.2-9%) (23) (ምስል 5e,i), በከባቢያዊ / ተዘዋዋሪ አቅጣጫ (ምስል 5h) ውስጥ ከሚገኙት የሴል ክፍሎች ጋር የሚዛመድ. የ GA ምልክት ማድረጊያ ለዚህ የሕዋስ ክፍፍል ባህሪ ያለውን አስተዋጽዖ ለመመርመር፣ በ IPR እና IPR ያልሆኑ የሕዋስ ክፍፍል መለኪያዎችን ለየብቻ ተንትነናል (ምስል 5i)። በ IPR ሴሎች ውስጥ ያለው የዲቪዥን አንግል ስርጭት ከ IPR-ያልሆኑ ሴሎች ወይም በአጠቃላይ SAM ውስጥ ካሉት ሴሎች ጋር ሲለያይ ተመልክተናል IPR ህዋሶች ከፍተኛ መጠን ያለው የጎን / ክብ ሴል ክፍሎችን ያሳያሉ, ማለትም 70-80 ° እና 80-90 ° (33.86% እና 30.71%, ተመጣጣኝ መጠን) (ምስል 5). ስለዚህ፣ የእኛ ምልከታ በከፍተኛ GA ምልክት እና በሴል ዲቪዥን አውሮፕላን አቅጣጫ ወደ ከባቢው አቅጣጫ ቅርበት ያለው፣ በ GA ምልክት እንቅስቃሴ እና በእድገት anisotropy መካከል ካለው ትስስር ጋር ያለውን ግንኙነት አሳይቷል (ምስል 5c፣ d)። የዚህን ማህበር የቦታ ጥበቃን የበለጠ ለማቋቋም ከP3 ጀምሮ በፕሪሞርዲየም ዙሪያ ያለውን የዲቪዥን አውሮፕላን አቅጣጫ በ IPR ህዋሶች ውስጥ ለካን፣ ምክንያቱም በዚህ ክልል ከP4 ጀምሮ ከፍተኛው የጂኤ ምልክት እንቅስቃሴ ተገኝቷል (ምስል 4)። በ P3 እና P4 ዙሪያ የ IPR መከፋፈል ማዕዘኖች ምንም ስታቲስቲካዊ ጉልህ ልዩነቶች አላሳዩም ፣ ምንም እንኳን በፒ 4 አካባቢ (ምስል 5j) ውስጥ የላተራል ሴል ክፍፍሎች ድግግሞሽ ጨምሯል። ነገር ግን በፒ 5 ዙሪያ ባሉ የአይፒአር ህዋሶች የሴል ዲቪዚዮን አውሮፕላኑ አቅጣጫ ልዩነት በስታቲስቲክስ ደረጃ ጉልህ በሆነ መልኩ ተዘዋውሮ የተንቀሳቃሽ ሴል ክፍፍሎች ድግግሞሽ (ምስል 5j) በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል። እነዚህ ውጤቶች አንድ ላይ ሆነው፣ የGA ምልክት ማድረጊያ በኤስኤኤም ውስጥ የሕዋስ ክፍሎችን አቅጣጫ መቆጣጠር እንደሚችል ይጠቁማሉ፣ ይህም ካለፉት ዘገባዎች40,41 ጋር የሚጣጣም ከፍተኛ የጂኤ ምልክት በ IPR ውስጥ የሕዋስ ክፍሎችን ወደ ጎን አቅጣጫ እንደሚያመጣ ያሳያል።
በ IPR ውስጥ ያሉ ህዋሶች ወደ ፕሪሞርዲያ እንደማይገቡ ተንብየዋል ነገር ግን ወደ internodes2,42,43. በ IPR ውስጥ ያለው የሕዋስ ክፍልፋዮች ተሻጋሪ አቅጣጫ በ internodes ውስጥ ያሉ የ epidermal ሕዋሳት ትይዩ ቁመታዊ ረድፎችን የተለመደ አደረጃጀትን ሊያስከትል ይችላል። ከላይ የተገለጹት ምልከታዎቻችን እንደሚጠቁሙት የ GA ምልክት ማድረግ በዚህ ሂደት ውስጥ የሕዋስ ክፍፍል አቅጣጫን በመቆጣጠር ሚና ይጫወታል።
የበርካታ DELLA ጂኖች ተግባር ማጣት የጂኤ ምላሽን ያመጣል፣ እና ዴላ ሚውቴሽን ይህንን መላምት44 ለመፈተሽ መጠቀም ይቻላል። በመጀመሪያ በSAM ውስጥ ያሉትን የአምስት ዲኤልኤ ጂኖች አገላለጽ ዘይቤዎች ተንትነናል። የ GUS line45 ግልባጭ ውህደት GAI፣ RGA፣ RGL1 እና RGL2 (በመጠነኛ መጠን) በSAM (ተጨማሪ ምስል 11a-d) ውስጥ እንደተገለጹ ያሳያል። በቦታው ማዳቀል በተጨማሪ GAI mRNA በተለይ በፕሪሞርዲያ እና በማደግ ላይ ባሉ አበቦች እንደሚከማች አሳይቷል (ተጨማሪ ምስል 11e)። RGL1 እና RGL3 mRNA በSAM ሸራ እና በአሮጌ አበባዎች ውስጥ ተገኝተዋል፣ RGL2 mRNA ግን በድንበር ክልል ውስጥ በብዛት ይገኝ ነበር (ተጨማሪ ምስል 11f–h)። የ pRGL3: RGL3-GFP SAM በቦታ ማዳቀል የተመለከተውን አገላለጽ አረጋግጧል እና የ RGL3 ፕሮቲን በ SAM ማዕከላዊ ክፍል ውስጥ ይከማቻል (ተጨማሪ ምስል 11i)። የpRGA::GFP-RGA መስመርን በመጠቀም፣ የ RGA ፕሮቲን በSAM ውስጥ እንደሚከማች ደርሰንበታል፣ነገር ግን ብዛቱ ከP4 ጀምሮ ባለው ድንበር ይቀንሳል (ተጨማሪ ምስል 11j)። በተለይም፣ የ RGL3 እና RGA አገላለጽ ቅጦች በqmRGA እንደሚታየው በ IPR ውስጥ ካለው ከፍተኛ የGA ምልክት እንቅስቃሴ ጋር የሚጣጣሙ ናቸው (ምስል 4)። ከዚህም በላይ እነዚህ መረጃዎች እንደሚያመለክቱት ሁሉም DELLAዎች በSAM ውስጥ እንደተገለጹ እና አገላለጻቸው በአጠቃላይ SAM ላይ እንደሚገኝ ያሳያል።
በመቀጠል በዱር-አይነት SAM (Ler, control) እና gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) mutants (ምስል 6a, b) ውስጥ ያለውን የሕዋስ ክፍፍል መለኪያዎችን ተንትነናል። የሚገርመው፣ በዴላ ግሎባል ሚውቴሽን SAM ውስጥ የሴል ክፍፍል አንግል ድግግሞሾችን ከዱር ዓይነት (ምስል 6 ሐ) ጋር በማነፃፀር በስታቲስቲካዊ ጉልህ ለውጥ ተመልክተናል። ይህ የዴላ ግሎባል ሙታንት ለውጥ ከ80-90 ዲግሪ ማዕዘናት ድግግሞሽ (34.71% vs. 24.55%) እና በመጠኑም ቢሆን ከ70-80° አንግል (23.78% vs. 20.18%) ማለትም ከ transverse ሴል ክፍፍሎች (ምስል 6c) ጋር በመጨመሩ ነው። በዴላ ግሎባል ሚውቴሽን (ምስል 6 ሐ) ውስጥ የማይተላለፉ ክፍፍሎች ድግግሞሽ (0-60°) ዝቅተኛ ነበር። በዴላ ግሎባል ሚውቴሽን (ስዕል 6 ለ) በ SAM ውስጥ የ transverse ሴል ክፍፍሎች ድግግሞሽ በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል። በ IPR ውስጥ ያሉት ተሻጋሪ ሴል ክፍፍሎች ድግግሞሽ በዴላ ግሎባል ሚውቴሽን ውስጥ ከዱር ዓይነት ጋር ሲነፃፀር ከፍ ያለ ነበር (ምስል 6d)። ከ IPR ክልል ውጭ፣ የዱር ዓይነት ይበልጥ ወጥ የሆነ የሕዋስ ክፍፍል ማዕዘኖች ስርጭት ነበረው፣ የዴላ ግሎባል ሙታንት ግን እንደ IPR ያሉ ታንጀንቲያል ክፍሎችን ይመርጣል (ምስል 6e)። እንዲሁም በSAM የ ga2 oxidase (ga2ox) quintuple mutants (ga2ox1-1፣ ga2ox2-1፣ ga2ox3-1፣ ga2ox4-1፣ እና ga2ox6-2) GA-ኢኖክቲቭ ሚውቴሽን ዳራ ውስጥ GA የሚከማችበትን እንዲሁም የሕዋስ ክፍፍሎችን አቅጣጫ ቆጥረናል። ከጂኤ ደረጃዎች መጨመር ጋር በሚጣጣም መልኩ የኩዊንቱፕል ga2ox mutant inflorescence SAM ከ Col-0 (ተጨማሪ ምስል 12 ሀ, ለ) የበለጠ ነበር, እና ከ Col-0 ጋር ሲነጻጸር, የ quintuple ga2ox SAM በተለየ ሁኔታ የተለያየ የሴል ክፍፍል ማዕዘኖች ስርጭት አሳይቷል, የማዕዘን ድግግሞሽ ከ 50 ° ወደ 9 ድጋሚ ከፍ ያለ ነው. ምስል 12 ሀ-ሐ). ስለዚህ፣ የGA ምልክት ማድረጊያ እና የጂኤ ክምችት ውህደትን ማግበር በ IPR እና በተቀረው SAM ውስጥ የጎን ሕዋስ ክፍሎችን እንደሚያመጣ እናሳያለን።
a, b 3D ምስላዊ የ L1 ንብርብር PI-stained Ler (a) እና ግሎባል ዴላ ሙታንት (ለ) SAM ኮንፎካል ማይክሮስኮፒን በመጠቀም። በSAM (ነገር ግን ፕሪሞርዲየም ሳይሆን) በ10-ሰአት ጊዜ ውስጥ የተሰሩ አዳዲስ የሕዋስ ግድግዳዎች ይታያሉ እና እንደ አንግል እሴታቸው ቀለም የተቀቡ ናቸው። ማስገቢያው SAM በ 0 ሰዓት ላይ ያሳያል. የቀለም አሞሌ ከታች በቀኝ ጥግ ላይ ይታያል. በ (ለ) ውስጥ ያለው ቀስት በአለምአቀፍ ዴላ ሚውታንት ውስጥ የተደረደሩ የሕዋስ ፋይሎችን ምሳሌ ይጠቁማል። ሙከራው በተመሳሳይ ውጤት ሁለት ጊዜ ተደግሟል። በሌር እና በግሎባል ዴላ መካከል ያለው የሴል ዲቪዥን አውሮፕላን አቅጣጫዎች ድግግሞሽ ስርጭት በጠቅላላው SAM (መ)፣ IPR (e) እና IPR ያልሆኑ (f) ንፅፅር። የፒ ዋጋዎች የተገኙት ባለ ሁለት ጭራ ኮልሞጎሮቭ-ስሚርኖቭ ሙከራን በመጠቀም ነው። f, g 3D ምስላዊ የ PI-stained SAM of Col-0 (i) እና pCUC2:: gai-1-VENUS (j) transgenic ዕፅዋትን የሚያሳይ ምስል። ፓነሎች (a, b) በ SAM ውስጥ በ 10 ሰአታት ውስጥ የተሰሩ አዲስ የሕዋስ ግድግዳዎች (ግን ፕሪሞርዲያ አይደሉም) ያሳያሉ. ሙከራው በተመሳሳይ ውጤት ሁለት ጊዜ ተደግሟል። h–j በ Col-0 እና pCUC2 :: gai-1-VENUS ተክሎች መካከል በጠቅላላው SAM (h)፣ IPR (i) እና IPR ያልሆኑ (j) ውስጥ የሚገኙትን የሕዋስ ክፍፍል አውሮፕላን አቅጣጫዎችን ድግግሞሽ ስርጭት ማነፃፀር። ፒ ዋጋዎች የተገኙት ባለ ሁለት ጭራ የኮልሞጎሮቭ-ስሚርኖቭ ሙከራን በመጠቀም ነው።
በመቀጠል የGA ምልክትን መከልከል የሚያስከትለውን ውጤት በIPR ውስጥ ሞከርን። ለዚህም፣ ከVENUS (በpCUC2 :: gai-1-VENUS መስመር ውስጥ) የተዋሃደ የበላይ የሆነ አሉታዊ gai-1 ፕሮቲን መግለጫን ለመንዳት የ cotyledon cup 2 (CUC2) አስተዋዋቂን ተጠቅመንበታል። በዱር-አይነት SAM ውስጥ፣ የCUC2 አራማጅ በSAM ውስጥ ያሉትን የብዙዎቹ IPRs መግለጫ፣ የጠረፍ ሴሎችን ጨምሮ፣ ከP4 ጀምሮ፣ እና ተመሳሳይ የተለየ አገላለጽ በpCUC2 :: gai-1-VENUS ተክሎች ላይ ተስተውሏል (ከዚህ በታች ይመልከቱ)። በ SAM ወይም IPR በ pCUC2 :: gai-1-VENUS ተክሎች ላይ ያለው የሕዋስ ክፍፍል ማዕዘኖች ስርጭት ከዱር ዓይነት በእጅጉ የተለየ አልነበረም, ምንም እንኳን ሳይታሰብ በእነዚህ ተክሎች ውስጥ IPR የሌላቸው ሴሎች በከፍተኛ ድግግሞሽ በ 80-90 ° (ምስል 6f-j) ተከፋፍለዋል.
የሕዋስ ክፍፍል አቅጣጫ የሚወሰነው በ SAM ጂኦሜትሪ ላይ ነው, በተለይም በቲሹ ኩርባ46 ምክንያት የሚፈጠረውን የመሸከም ጭንቀት. ስለዚህ የ SAM ቅርጽ በዴላ ግሎባል ሚውቴሽን እና pCUC2 :: gai-1-VENUS ተክሎች ውስጥ ተቀይሮ እንደሆነ ጠየቅን. ቀደም ሲል 12 እንደተዘገበው፣ የዴላ ግሎባል ሚውቴሽን SAM መጠን ከዱር ዓይነት የበለጠ ነበር (ተጨማሪ ምስል 13a፣ b, d)። በቦታው ላይ የCLV3 እና STM አር ኤን ኤ ማዳቀል በዴላ ሚውቴሽን ውስጥ ያለውን የሜሪስተም መስፋፋት አረጋግጧል እና የስቲም ሴል ኒቼን (ተጨማሪ ምስል 13e፣ f፣ h, i) የጎን መስፋፋትን አሳይቷል። ይሁን እንጂ የSAM ኩርባ በሁለቱም ጂኖታይፕስ (ተጨማሪ ምስል 13k, m, n, p) ተመሳሳይ ነበር. በ gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant ውስጥ ከዱር ዓይነት ጋር ሲነፃፀር የመቀየሪያ ለውጥ ሳይኖር ተመሳሳይ መጠን መጨመር አስተውለናል (ተጨማሪ ምስል 13c, d, g, j, l, o, p). የሕዋስ ክፍፍል አቅጣጫ ድግግሞሽ በዴላ ባለአራት ሙታንት ውስጥም ተጎድቷል፣ ነገር ግን በተወሰነ ደረጃ ከዴላ ሞኖሊቲክ ሚውቴሽን (ተጨማሪ ምስል 12d-f)። ይህ የመጠን ውጤት፣ በኩርባው ላይ ካለው ተጽእኖ እጥረት ጋር፣ ቀሪው የ RGL3 እንቅስቃሴ በዴላ አራት እጥፍ የሚውቴሽን እንቅስቃሴ በዲኤልኤ እንቅስቃሴ መጥፋት ምክንያት የሚከሰተውን የሕዋስ ክፍፍል አቅጣጫ ለውጦችን እንደሚገድብ እና በኤስኤምኤስ ጂኦሜትሪ ለውጥ ሳይሆን በጂኤ ምልክት እንቅስቃሴ ለውጥ ምክንያት የላተራል ሴል ክፍሎች ለውጦች እንደሚከሰቱ ይጠቁማል። ከላይ እንደተገለፀው የCUC2 አራማጅ የ IPR አገላለፅን በSAM ውስጥ ከፒ 4 ጀምሮ ያንቀሳቅሳል (ተጨማሪ ምስል 14 ሀ, ለ) እና በተቃራኒው pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM መጠኑ ይቀንሳል ነገር ግን ከፍተኛ ኩርባ ነበረው (ተጨማሪ ምስል 14c–h)። ይህ በ pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM ሞርፎሎጂ ውስጥ ያለው ለውጥ ከዱር ዓይነት ጋር ሲነፃፀር የተለየ የሜካኒካዊ ጭንቀቶች ስርጭትን ሊያስከትል ይችላል, ይህም ከፍተኛ የከባቢያዊ ጭንቀቶች ከ SAM center47 ባጭር ርቀት ይጀምራሉ. በአማራጭ፣ በ pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM ሞርፎሎጂ ለውጦች በትራንስጂን አገላለጽ48 በተከሰቱ የክልል ሜካኒካል ባህሪዎች ለውጦች ሊከሰቱ ይችላሉ። በሁለቱም ሁኔታዎች፣ ይህ የኛን ምልከታ በማብራራት ሴሎች በከባቢያዊ/ተዘዋዋሪ አቅጣጫ የመከፋፈል እድላቸውን በመጨመር በ GA ምልክት ላይ የተደረጉ ለውጦችን ተፅእኖ በከፊል ሊቀንስ ይችላል።
አንድ ላይ ስንጠቃለል፣ ከፍ ያለ የGA ምልክት በ IPR ውስጥ ባለው የሕዋስ ክፍል አውሮፕላን የጎን አቅጣጫ ላይ ንቁ ሚና እንደሚጫወት መረጃዎቻችን ያረጋግጣሉ። በተጨማሪም የሜሪስተም ኩርባ በ IPR ውስጥ ባለው የሕዋስ ክፍል አውሮፕላን አቅጣጫ ላይ ተጽዕኖ እንደሚያሳድር ያሳያሉ።
በ IPR ውስጥ ያለው የዲቪዥን አውሮፕላን ተዘዋዋሪ አቅጣጫ ፣ በከፍተኛ የ GA ምልክት እንቅስቃሴ ምክንያት ፣ GA በኤፒደርማል ውስጥ የሚገኘውን ሴሉላር ድርጅትን ለመለየት በ SAM ውስጥ ባለው የራዲያል ሴል ፋይል አስቀድሞ እንደሚያደራጅ ይጠቁማል። በእርግጥ እንደነዚህ ያሉት የሕዋስ ፋይሎች በ SAM ምስሎች ዴላ ግሎባል ሚውቴሽን (ምስል 6 ለ) ውስጥ በተደጋጋሚ ይታዩ ነበር። ስለዚህ በ SAM ውስጥ ያለውን የጂኤ ምልክት የቦታ ንድፍ የእድገት ተግባርን የበለጠ ለመዳሰስ በ IPR ውስጥ ያሉ ሴሎችን በዱር-አይነት (ሌር እና ኮል-0) ፣ ዴላ ግሎባል ሚውቴሽን እና pCUC2 :: gai-1-VENUS transgenic ተክሎችን ለመተንተን ጊዜ ያለፈበት ምስልን ተጠቀምን።
QmRGA የሚያሳየው በ IPR ውስጥ የGA ምልክት ማድረጊያ እንቅስቃሴ ከP1/P2 ከፍ ያለ እና በP4 ላይ ከፍተኛ ደረጃ ላይ እንደደረሰ፣ እና ይህ ንድፍ በጊዜ ሂደት ቋሚ ሆኖ እንደቀጠለ ነው (ምስል 4a–f እና ተጨማሪ ምስል 8c–f, k)። በ IPR ውስጥ ያሉትን የሕዋሶች የቦታ አደረጃጀት ለመተንተን GA ሲግናልን ለመተንተን ከላይ እና ከ P4 ጎን ለጎን የ Ler IPR ህዋሶችን እንደየእድገታቸው እጣ ፈንታ ከ 34 ሰአታት በኋላ የተተነተኑ ሲሆን ይህም ማለት ከሁለት በላይ የፕላስቲድ ጊዜዎች, ይህም ከ P1/P2 እስከ P4 ባለው የፕሪሞርዲየም እድገት ወቅት IPR ሴሎችን እንድንከተል ያስችለናል. ሶስት የተለያዩ ቀለሞችን እንጠቀማለን-በፒ 4 አቅራቢያ ባለው ፕሪሞርዲየም ውስጥ ለተካተቱት ሴሎች ቢጫ ፣ በ IPR ውስጥ ላሉት አረንጓዴ እና በሁለቱም ሂደቶች ውስጥ ለተሳተፉት ሐምራዊ (ምስል 7a-c)። በ t0 (0 ሰ) ፣ 1-2 የ IPR ህዋሶች በ P4 ፊት ለፊት ይታያሉ (ምስል 7 ሀ)። እንደተጠበቀው፣ እነዚህ ህዋሶች ሲከፋፈሉ፣ በዋነኛነት ያደረጉት በተሻጋሪ ክፍፍል አውሮፕላን (ምስል 7a-c) በኩል ነው። ተመሳሳይ ውጤቶች በ Col-0 SAM (በ P3 ላይ በማተኮር, ድንበሩ በሌር ውስጥ ከ P4 ጋር ተመሳሳይ ነው), ምንም እንኳን በዚህ ጂኖታይፕ ውስጥ በአበባው ድንበር ላይ የተገነባው እጥፋት የ IPR ሴሎችን በበለጠ ፍጥነት ደብቋል (ምስል 7g-i). ስለዚህ, የ IPR ሴሎች የመከፋፈል ንድፍ ህዋሶችን ወደ ራዲያል ረድፎች ቀድመው ያደራጃቸዋል, ልክ እንደ internodes. የጨረር ረድፎች አደረጃጀት እና የ IPR ህዋሶች በተከታታይ የአካል ክፍሎች መካከል መደረጉ እነዚህ ህዋሶች ኢንተርኖዶል ቅድመ አያቶች መሆናቸውን ይጠቁማሉ።
እዚህ፣ የ GA ምልክት ማድረጊያ ባዮሴንሰር፣qmRGA፣ በቁጥር የ GA ምልክት ማድረጊያ እንቅስቃሴን በጂኤ እና በጂኤ ተቀባይ ተቀባይ ውህድ የተገኙ እንቅስቃሴዎችን በቁጥር ካርታ መስራት የሚያስችል እና በውስጣዊ የምልክት መንገዶች ላይ የሚደረጉ ጣልቃገብነቶችን በመቀነስ በሴሉላር ደረጃ የGA ተግባር ላይ መረጃን የሚሰጥ። ለዚህም፣ የተሻሻለ DELLA ፕሮቲን፣ mRGA፣ የ DELLA መስተጋብር አጋሮችን የማገናኘት አቅሙን ያጣ ነገር ግን በGA ለተፈጠረው ፕሮቲዮሊሲስ ስሜታዊ ሆኖ የሚቆይ ገንብተናል። qmRGA በ GA ደረጃዎች ውስጥ ለሁለቱም ውጫዊ እና ውስጣዊ ለውጦች ምላሽ ይሰጣል ፣ እና ተለዋዋጭ የመረዳት ባህሪያቱ በእድገት ወቅት በ GA ምልክት ማድረጊያ እንቅስቃሴ ላይ የቦታ ለውጦችን ለመገምገም ያስችላል። qmRGA ለገለፃው የሚውለውን አስተዋዋቂ በመቀየር ለተለያዩ ቲሹዎች (አስፈላጊ ከሆነ) እና የ GA ምልክት ማድረጊያ መንገድ ጥበቃ ባህሪ እና የ PFYRE motif በ angiosperms በኩል ለተለያዩ ቲሹዎች ሊላመድ ስለሚችል በጣም ተለዋዋጭ መሳሪያ ነው. ከዚህ ጋር በሚስማማ መልኩ፣ በሩዝ SLR1 DELLA ፕሮቲን (HYY497AAA) ውስጥ ያለው ተመጣጣኝ ሚውቴሽን የ SLR1ን የእድገት መጨናነቅ እንቅስቃሴን በመጨፍለቅ ከኤምአርጂኤ23 ጋር በሚመሳሰል መልኩ የGA-mediated deradaration በትንሹ እንዲቀንስ ታይቷል። በተለይም በቅርብ ጊዜ በአረብኛ የተደረጉ ጥናቶች እንደሚያሳዩት በ PFYRE ጎራ (S474L) ውስጥ ያለው አንድ የአሚኖ አሲድ ሚውቴሽን የ RGA ግልባጭ እንቅስቃሴን ከጽሑፍ ግልባጭ ፋክተር አጋሮች ጋር የመገናኘት ችሎታውን ሳይነካው ለውጦታል። ምንም እንኳን ይህ ሚውቴሽን በ mRGA ውስጥ ካሉት 3 አሚኖ አሲድ መለወጫዎች ጋር በጣም የቀረበ ቢሆንም፣ ጥናቶቻችን እንደሚያሳዩት እነዚህ ሁለቱ ሚውቴሽን የ DELLA ልዩ ባህሪያትን ይቀይራሉ። ምንም እንኳን አብዛኛዎቹ የጽሑፍ ግልባጭ አጋሮች ከLHR1 እና SAW ከ DELLA26,51 ጎራዎች ጋር የተቆራኙ ቢሆንም፣ በPFYRE ጎራ ውስጥ ያሉ አንዳንድ የተጠበቁ አሚኖ አሲዶች እነዚህን ግንኙነቶች ለማረጋጋት ሊረዱ ይችላሉ።
የኢንተርኖድ ልማት በእጽዋት አርክቴክቸር እና የምርት መሻሻል ውስጥ ቁልፍ ባህሪ ነው። qmRGA በ IPR internode progenitor ሕዋሳት ውስጥ ከፍ ያለ የGA ምልክት እንቅስቃሴ አሳይቷል። መጠናዊ ኢሜጂንግ እና ጄኔቲክስን በማጣመር፣ የGA ምልክት ማድረጊያ ቅጦች በ SAM epidermis ውስጥ ክብ/ተለዋዋጭ ሴል ዲቪዥን አውሮፕላኖችን እንደሚበልጡ፣ ለኢንተርኖድ ልማት የሚያስፈልገውን የሕዋስ ክፍፍል ድርጅትን በመቅረጽ አሳይተናል። በዕድገት ወቅት በርካታ የሕዋስ ክፍፍል አውሮፕላን አቅጣጫ ተቆጣጣሪዎች ተለይተዋል52,53. የእኛ ስራ የ GA ምልክት ማድረጊያ እንቅስቃሴ ይህንን ሴሉላር መለኪያ እንዴት እንደሚቆጣጠር ግልጽ ምሳሌ ይሰጣል። DELLA ከቅድመ-folding ፕሮቲን ውስብስቦች41 ጋር መስተጋብር መፍጠር ይችላል፣ስለዚህ GA ምልክት ማድረጊያ የሴል ዲቪዥን አውሮፕላን አቅጣጫን በቀጥታ በኮርቲካል ማይክሮቱቡል አቅጣጫ40,41,54,55 ላይ ተጽዕኖ ሊያሳድር ይችላል። ሳይታሰብ በSAM ውስጥ የከፍተኛ የጂኤ ምልክት እንቅስቃሴ ቁርኝት የሕዋስ ማራዘም ወይም መከፋፈል ሳይሆን የእድገት አኒሶትሮፒ ብቻ መሆኑን አሳይተናል፣ ይህም በ IPR ውስጥ ባለው የሕዋስ ክፍፍል አቅጣጫ ላይ ካለው የ GA ቀጥተኛ ተጽዕኖ ጋር የሚስማማ ነው። ነገር ግን፣ ይህ ተፅዕኖ ቀጥተኛ ያልሆነ ሊሆን እንደሚችል ማስቀረት አንችልም፣ ለምሳሌ በ GA-የሚፈጠር የሕዋስ ግድግዳ ልስላሴ56 መካከለኛ። የሕዋስ ግድግዳ ባህሪያት ለውጦች ሜካኒካል ውጥረት 57,58 ያስከትላሉ, ይህ ደግሞ የሴል ዲቪዥን አውሮፕላን አቅጣጫ ላይ ተጽዕኖ ሊያሳድር ይችላል, የ cortical microtubules39,46,59 አቅጣጫ ላይ ተጽዕኖ ያሳድራል. በ GA-የሚፈጠረው መካኒካል ውጥረት እና የማይክሮ ቲዩቡል አቅጣጫን በ GA የተቀናጀ ተፅእኖዎች በ IPR ውስጥ የተወሰነ የሕዋስ ክፍፍል ዝንባሌን በማመንጨት ኢንተርኖዶችን ለመወሰን ሊሳተፉ ይችላሉ እና ይህንን ሀሳብ ለመፈተሽ ተጨማሪ ጥናቶች ያስፈልጋሉ። በተመሳሳይም ቀደም ሲል የተደረጉ ጥናቶች የ DELLA መስተጋብር ፕሮቲኖች TCP14 እና 15 በ internode formation60,61 ቁጥጥር ውስጥ ያለውን ጠቀሜታ አጉልተው አሳይተዋል እና እነዚህ ምክንያቶች የ GA እርምጃን ከ BREVIPEDICELLUS (BP) እና PENNYWISE (PNY) ጋር ሊያስተላልፍ ይችላል, ይህም internode እድገትን ይቆጣጠራል እና በ GA signaling2,62 ላይ ተጽእኖ ያሳድራል. DELLAዎች ከብራሲኖስቴሮይድ፣ ኤቲሊን፣ ጃስሞኒክ አሲድ እና አቢሲሲክ አሲድ (ኤቢኤ) ምልክት ማድረጊያ መንገዶች63,64 ጋር መስተጋብር ስለሚፈጥሩ እና እነዚህ ሆርሞኖች በማይክሮቱቡል አቅጣጫ65 ላይ ተጽእኖ ሊያሳድሩ ስለሚችሉ የGA በሴል ክፍፍል አቅጣጫ ላይ ያለው ተጽእኖ በሌሎች ሆርሞኖች መካከለኛ ሊሆን ይችላል።
ቀደምት የሳይቶሎጂ ጥናቶች እንደሚያሳዩት የአረብኛ ሳም ውስጣዊ እና ውጫዊ ክልሎች ለ internode እድገት2,42. GA በውስጠኛው ቲሹስ12 ውስጥ የሕዋስ ክፍፍልን በንቃት የሚቆጣጠር መሆኑ በSAM ውስጥ የሜሪስተም እና የኢንተርኖድ መጠንን ለመቆጣጠር የ GA ድርብ ተግባርን ይደግፋል። የአቅጣጫ ሕዋስ ክፍፍል ንድፍ በውስጠኛው የሳም ቲሹ ውስጥ በጥብቅ ቁጥጥር ይደረግበታል, እና ይህ ደንብ ለግንዱ እድገት አስፈላጊ ነው52. በውስጠኛው SAM ድርጅት ውስጥ የሴል ዲቪዥን አውሮፕላኑን በማቀናጀት GA እንዲሁ ሚና ይጫወት እንደሆነ መመርመር አስደሳች ይሆናል ፣ በዚህም በኤስኤምኤስ ውስጥ የ internodes ዝርዝር እና እድገትን ያመሳስላል።
ተክሎች በአፈር ውስጥ በብልቃጥ ውስጥ ይበቅላሉ ወይም 1x Murashige-Skoog (MS) መካከለኛ (Duchefa) በ 1% sucrose እና 1% agar (Sigma) በ 1% sucrose እና 1% agar (Sigma) ተጨምረዋል (ሲግማ) በመደበኛ ሁኔታዎች (16 ሰ ብርሃን, 22 ° ሴ) ከ hypocotyl እና ከስር የእድገት ሙከራዎች በስተቀር, በቋሚ ብርሃን እና በ 22 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ባሉ ቋሚ ሳህኖች ላይ ችግኞች ይበቅላሉ. ለናይትሬት ሙከራዎች እፅዋቶች በተሻሻለ ኤምኤስ መካከለኛ (bioWORLD የእፅዋት መካከለኛ) ላይ በበቂ ናይትሬት (0 ወይም 10 mM KNO3)፣ 0.5 mM NH4-succinate፣ 1% sucrose እና 1% A-agar (Sigma) በረጅም ቀን ሁኔታዎች ተጨምረዋል።
በpDONR221 ውስጥ የገባው GID1a cDNA ከpDONR P4-P1R-pUBQ10 እና pDONR P2R-P3-mCherry በpB7m34GW ውስጥ pUBQ10::GID1a-mCherryን እንደገና ተቀላቅሏል። በpDONR221 ውስጥ የገባው IDD2 ዲኤንኤ ወደ pB7RWG266 ተቀላቅሏል p35S:ID2-RFP። pGID1b::2xmTQ2-GID1b ለማመንጨት፣ ከጂአይዲ1ብ ኮድዲንግ ክልል ወደላይ 3.9 ኪ.ባ ቁራጭ እና 4.7 ኪባ ቁራጭ GID1b cDNA (1.3 kb) እና terminator (3.4 kb) የያዘ ፕሪመር በመጀመሪያ በተጨማሪ ሠንጠረዥ 4 ውስጥ ተጨምሯል እና ከዚያ በፒዲኤንፒ 1 ውስጥ ገባ። ፊሸር ሳይንቲፊክ) እና pDONR P2R-P3 (ቴርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ) እንደቅደም ተከተላቸው፣ እና በመጨረሻም ከpDONR221 2xmTQ268 ጋር እንደገና ተቀላቅለው ወደ pGreen 012567 ኢላማ ቬክተር ጌትዌይ ክሎኒንግ በመጠቀም። pCUC2::LSSmOrangeን ለማመንጨት የCUC2 አራማጅ ቅደም ተከተል (3229 ቢፒ ከ ATG ወደላይ) በመቀጠል የትልቅ ስቶክስ-የተቀየረ mOrange (LSSmOrange) 69 ከ N7 የኑክሌር አከባቢ ምልክት ጋር እና የ NOS ግልባጭ ተርሚነተር ወደ pGreen ቬቴግሪን ካናሚ 3 ተሰብስበዋል ። እንደገና የማዋሃድ ስርዓት (ኢንቫይሮጅን). የእጽዋት ሁለትዮሽ ቬክተር ወደ Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 ገብቷል እና ወደ ኒኮቲያና ቤንታሚያና ቅጠሎች በአግሮባክቲሪየም ሰርጎ መግባት ዘዴ እና ወደ አረብቢዶፕሲስ ታሊያና ኮል-0 በአበባ መጥለቅለቅ ዘዴ ገብቷል። pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry እና pCLV3::mCherry-NLS qmRGA እንደቅደም ተከተላቸው ከF3 እና F1 ዘሮች ተለይተዋል።
አር ኤን ኤ በቦታው ማዳቀል በግምት 1 ሴ.ሜ ርዝመት ያለው የተኩስ tips72 ላይ ተካሂዷል፣ እነዚህም ተሰብስበው ወዲያውኑ በኤፍኤኤ መፍትሄ (3.7% ፎርማለዳይድ፣ 5% አሴቲክ አሲድ፣ 50% ኢታኖል) ቀድሞ ወደ 4 ° ሴ እንዲቀዘቅዝ ተደርጓል። ከ2 × 15 ደቂቃ የቫኩም ሕክምናዎች በኋላ፣ መጠገኛው ተቀይሮ ናሙናዎች በአንድ ሌሊት ተተክለዋል። GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, እና RGL3 ሲዲኤንኤዎች እና አንቲሴንስ መመርመሪያዎች የእነሱ 3′-UTRs በማሟያ ሠንጠረዥ 3 ላይ የሚታየውን ፕሪመር በመጠቀም በRosier et al.73 ተብራርቷል። Digoxigenin-የተሰየሙ መመርመሪያዎች digoxigenin ፀረ እንግዳ አካላት (3000-fold dilution, Roche, ካታሎግ ቁጥር: 11 093 274 910) እና ክፍሎች 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ፎስፌት (BCIP, 250e 250-fold diluphosphate) ጋር ተበክሏል. 200-fold dilution) መፍትሄ.
የልጥፍ ሰዓት፡- ፌብሩዋሪ-10-2025