ቁጥራዊ የጊቤሬሊን ባዮሴንሰር በሾት አፒካል ሜሪስቴም ውስጥ በኢንተርኖድ ዝርዝር መግለጫ ውስጥ የጊቤሬሊንን ሚና ያሳያል

የተኩስ አፒካል ሜሪስቴም (SAM) እድገት ለግንዱ አርክቴክቸር ወሳኝ ነው።ጊቤሬሊንስ(GAs) የእፅዋትን እድገት በማስተባበር ረገድ ቁልፍ ሚና ይጫወታሉ፣ ነገር ግን በSAM ውስጥ ያላቸው ሚና አሁንም በቂ ግንዛቤ የለውም። እዚህ፣ የDELLA ፕሮቲንን በGA ትራንስክሪፕሽን ምላሽ ውስጥ ያለውን አስፈላጊ የቁጥጥር ተግባር ለመግታት እና በGA እውቅና ላይ ያለውን መበስበስን በመጠበቅ በGA ትራንስክሪፕሽን ምላሽ ውስጥ ያለውን አስፈላጊ የቁጥጥር ተግባር ለመግታት በዲዛይን በማዘጋጀት የGA ምልክት ባዮሴንሰር አዘጋጅተናል። ይህ መበስበስ ላይ የተመሰረተ ባዮሴንሰር በልማት ወቅት በGA ደረጃዎች እና በሴሉላር ዳሰሳ ላይ የተደረጉ ለውጦችን በትክክል እንደሚመዘግብ እናሳያለን። ይህንን ባዮሴንሰር በSAM ውስጥ የGA ምልክት እንቅስቃሴን ለማሳየት ተጠቅመናል። ከፍተኛ የGA ምልክቶች በዋናነት በኦርጋን ፕሪሞርዲያ መካከል በሚገኙ ሴሎች ውስጥ እንደሚገኙ እናሳያለን፣ እነዚህም ወደ ኢንተርኖድ ሴሎች ቀዳሚዎች ናቸው። የአጠቃቀም ማሻሻያ እና የኪሳራ አቀራረቦችን በመጠቀም፣ GA የሴል ክፍፍል ፕላን አቅጣጫን እንደሚቆጣጠር እናሳያለን፣ ይህም የኢንተርኖዶች ቀኖናዊ የሴሉላር አደረጃጀትን በማቋቋም በSAM ውስጥ የኢንተርኖድ ዝርዝር መግለጫን እንደሚያስተዋውቅ እናሳያለን።
በተተኮሰበት ጫፍ ላይ የሚገኘው የተተኮሰ አፒካል ሜሪስቴም (SAM)፣ እንቅስቃሴያቸው በእፅዋቱ ዕድሜ በሙሉ በሞዱላር እና በተደጋጋሚ መንገድ የጎን አካላትን እና የግንድ ኖዶችን የሚያመነጭ የስቴም ሴሎችን ይዟል። እነዚህ ተደጋጋሚ ክፍሎች ወይም የእፅዋት ኖዶች በኖዶች ላይ ኢንተርኖዶችን እና የጎን አካላትን እና በቅጠል አክሲልስ ውስጥ አክስላሪ ሜሪስቴሞችን ያካትታሉ1። የእፅዋት ኖዶች እድገት እና አደረጃጀት በእድገት ወቅት ይለወጣል። በአረብዲፖሲስ፣ የኢንተርኖዳል እድገት በእፅዋት ደረጃ ላይ ይጨናገፋል፣ እና አክስላሪ ሜሪስቴሞች በሮዜት ቅጠሎች ዘንጎች ውስጥ እንቅልፍ ይወስዳሉ። ወደ አበባ ደረጃ በሚሸጋገርበት ጊዜ፣ SAM የፍሉክስ ሜሪስቴም ይሆናል፣ ረጅም ኢንተርኖዶችን እና አክስላሪ ቡቃያዎችን፣ በካውሊን ቅጠሎች ዘንጎች ውስጥ ቅርንጫፎችን እና በኋላም ቅጠል የሌላቸው አበቦችን ያመነጫል። የቅጠሎችን፣ የአበቦችን እና የቅርንጫፍ ቅርንጫፎችን የሚቆጣጠሩትን ዘዴዎች በመረዳት ረገድ ጉልህ እድገት ብናደርግም፣ ኢንተርኖዶች እንዴት እንደሚፈጠሩ በአንጻራዊ ሁኔታ ብዙም የሚታወቅ ነገር የለም።
የGAs የስፓቲዮቴምፖራል ስርጭትን መረዳት በተለያዩ ሕብረ ሕዋሳት እና በተለያዩ የእድገት ደረጃዎች ውስጥ የእነዚህን ሆርሞኖች ተግባራት በተሻለ ለመረዳት ይረዳል። በራሱ ፕሮሞተር እርምጃ ስር የሚገለጠውን የRGA-GFP ውህደት መበላሸት በ roots15,16 ውስጥ ስላለው አጠቃላይ የGA ደረጃዎች ቁጥጥር አስፈላጊ መረጃ ይሰጣል። ሆኖም፣ የRGA አገላለጽ በቲሹዎች17 ይለያያል እና በ GA18 ቁጥጥር ይደረግበታል። ስለዚህ፣ የRGA ፕሮሞተር ልዩነት አገላለጽ በ RGA-GFP የሚታየውን የፍሎረሰንስ ንድፍ ሊያስከትል ይችላል እና ስለዚህ ይህ ዘዴ መጠናዊ አይደለም። በቅርቡ፣ ባዮአክቲቭ ፍሎረሰንስ (Fl)-የተሰየመ GA19,20 በ root endocortex ውስጥ የGA ክምችት እና የሴሉላር ደረጃውን በ GA ትራንስፖርት መቆጣጠርን አሳይቷል። በቅርቡ፣ የ GA FRET ዳሳሽ nlsGPS1 የGA ደረጃዎች በስሮች፣ በክር እና በጨለማ በሚያድጉ ሃይፖኮቲልስ21 ውስጥ ካለው የሴል ማራዘሚያ ጋር እንደሚዛመዱ አሳይቷል። ሆኖም፣ እንዳየነው፣ የGA ክምችት የGA ምልክት እንቅስቃሴን የሚቆጣጠር ብቸኛው መለኪያ አይደለም፣ ምክንያቱም ውስብስብ የስሜት ህዋሳት ሂደቶች ላይ የተመሰረተ ነው። እዚህ፣ ስለ DELLA እና GA የምልክት መንገዶች ባለን ግንዛቤ ላይ በመመስረት፣ ለ GA ምልክት ማድረጊያ መበላሸት ላይ የተመሠረተ የራቲዮሜትሪክ ባዮሴንሰር እድገት እና ባህሪ ሪፖርት እናደርጋለን። ይህንን የቁጥር ባዮሴንሰር ለማዘጋጀት፣ ከፍሎረሰንት ፕሮቲን ጋር የተዋሃደ እና በቲሹዎች ውስጥ በሁሉም ቦታ የሚገለጽ የተዋሃደ GA-ስሜታዊ RGA እንዲሁም GA-ስሜታዊ ያልሆነ የፍሎረሰንት ፕሮቲን ተጠቅመናል። የተዋሃደ RGA ፕሮቲን ውህዶች በሁሉም ቦታ ሲገለጽ በኢንዶጅናል GA ምልክት ላይ ጣልቃ እንደማይገቡ እና ይህ ባዮሴንሰር ከፍተኛ የስፓቲዮቴምፖራል ጥራት ባለው የዳሰሳ መሳሪያ በGA ግብዓት እና GA ምልክት ሂደት የሚመጣውን የምልክት እንቅስቃሴ መጠን ሊለካ እንደሚችል እናሳያለን። ይህንን ባዮሴንሰር የGA ምልክት እንቅስቃሴን የቦታ ቴምፖራል ስርጭትን ለማሳየት እና GA በSAM epidermis ውስጥ ያለውን የሴሉላር ባህሪ እንዴት እንደሚቆጣጠር ለመለካት ተጠቅመናል። GA በኦርጋን ፕሪሞርዲያ መካከል የሚገኘውን የSAM ሴሎች የመከፋፈል ፕላን አቅጣጫ እንደሚቆጣጠር እናሳያለን፣ በዚህም የኢንተርኖዱን ቀኖናዊ ሴሉላር አደረጃጀት ይገልፃል።
በመጨረሻም፣ qmRGA እያደገ ባለው ሃይፖኮቲልስ በመጠቀም በኢንዶጅናል GA መጠን ላይ ለውጦችን ሪፖርት ማድረግ ይችል እንደሆነ ጠይቀናል። ቀደም ሲል ናይትሬት የGA ውህደትን በመጨመር እና በተራው ደግሞ የDELLA34 መበላሸትን በመጨመር እድገትን እንደሚያነቃቃ አሳይተናል። በዚህ መሠረት፣ በብዛት የናይትሬት አቅርቦት (10 mM NO3−) ስር በሚበቅሉ pUBQ10::qmRGA ችግኞች ውስጥ ያለው ሃይፖኮቲል ርዝመት በናይትሬት እጥረት ባለባቸው ሁኔታዎች ውስጥ ከሚበቅሉት ችግኞች በእጅጉ እንደሚረዝም አስተውለናል (ተጨማሪ ምስል 6a)። ከእድገት ምላሽ ጋር በሚስማማ መልኩ፣ የGA ምልክቶች ከ10 mM NO3− ሁኔታዎች በታች በሚበቅሉ ችግኞች ውስጥ ናይትሬት በሌለበት ጊዜ ከሚበቅሉ ችግኞች ይልቅ ከፍ ያሉ ነበሩ (ተጨማሪ ምስል 6b፣ c)። ስለዚህ፣ qmRGA በGA ክምችት ውስጥ በሚከሰቱ ውስጣዊ ለውጦች ምክንያት በሚከሰቱ የGA ምልክት ለውጦች ላይ ክትትል ያስችላል።
በ qmRGA የተገኘው የGA ምልክት እንቅስቃሴ በGA ክምችት እና በGA ግንዛቤ ላይ የተመሰረተ መሆኑን ለመረዳት፣ በዳሳሽ ዲዛይን ላይ በመመስረት እንደሚጠበቀው፣ በእፅዋት እና በመራቢያ ሕብረ ሕዋሳት ውስጥ ያሉትን ሦስቱን የGID1 ተቀባዮች አገላለጽ ተንትነናል። በችግኝት ውስጥ፣ የGID1-GUS ዘጋቢ መስመር GID1a እና c በኮቲሌዶኖች ውስጥ በከፍተኛ ሁኔታ የተገለጹ መሆናቸውን አሳይቷል (ምስል 3a-c)። በተጨማሪም፣ ሦስቱም ተቀባዮች በቅጠሎች፣ በጎን ሥር ፕሪሞርዲያ፣ በሥሩ ጫፎች (ከGID1b ሥር ክዳን በስተቀር) እና በቫስኩላር ሲስተም (ምስል 3a-c) ተገልጸዋል። በአበባው ውስጥ SAM የGUS ምልክቶችን ለGID1b እና 1c ብቻ አግኝተናል (ተጨማሪ ምስል 7a-c)። በቦታ ውስጥ ሃይብሪዴሽን እነዚህን የመግለፅ ቅጦች አረጋግጧል እና GID1c በSAM ውስጥ በዝቅተኛ ደረጃዎች በተመሳሳይ ሁኔታ ይገለጻል፣ GID1b ደግሞ በSAM ዳርቻ ላይ ከፍተኛ አገላለጽ አሳይቷል (ተጨማሪ ምስል 7d-l)። የpGID1b::2xmTQ2-GID1b የትርጉም ውህደት እንዲሁም በSAM መሃል ላይ ካለው ዝቅተኛ ወይም ምንም አገላለጽ እስከ በኦርጋን ድንበሮች ላይ ካለው ከፍተኛ አገላለጽ (ተጨማሪ ምስል 7m) ድረስ የተደረደረ የGID1b አገላለጽ ክልል አሳይቷል። ስለዚህ፣ የGID1 ተቀባዮች በቲሹዎች ውስጥ እና በቲሹዎች ውስጥ በእኩል መጠን አልተከፋፈሉም። በቀጣዮቹ ሙከራዎች፣ የGID1 ከመጠን በላይ አገላለጽ (pUBQ10::GID1a-mCherry) በሃይፖኮቲሎች ውስጥ የqmRGA ስሜታዊነት ወደ ውጫዊ GA አተገባበር እንደጨመረ አስተውለናል (ምስል 3d፣ e)። በተቃራኒው፣ በሃይፖኮቲል ውስጥ በqd17mRGA የሚለካው ፍሎረሰንስ ለGA3 ሕክምና ስሜታዊ ያልሆነ ነበር (ምስል 3f፣ g)። ለሁለቱም ምርመራዎች፣ ችግኞች የዳሳሹን ፈጣን ባህሪ ለመገምገም ከፍተኛ የGA ክምችት (100 μM GA3) ታክመዋል፣ ይህም ከGID1 ተቀባዩ ጋር የመያያዝ ችሎታው ተሻሽሏል ወይም ጠፍቷል። እነዚህ ውጤቶች አንድ ላይ ሆነው የ qmRGA ባዮሴንሰር እንደ GA እና GA ዳሳሽ የተጣመረ ተግባር እንደሚያገለግል ያረጋግጣሉ፣ እና የ GID1 ተቀባይ ልዩነት አገላለጽ የዳሳሹን ልቀት በከፍተኛ ሁኔታ ሊለውጠው እንደሚችል ይጠቁማሉ።
እስካሁን ድረስ በSAM ውስጥ የGA ምልክቶች ስርጭት ግልጽ አይደለም። ስለዚህ፣ በL1 ንብርብር (epidermis፤ ምስል 4a፣ b፣ ዘዴዎችን እና ተጨማሪ ዘዴዎችን ይመልከቱ) ላይ በማተኮር የGA ምልክት እንቅስቃሴ ከፍተኛ ጥራት ያላቸውን የቁጥር ካርታዎችን ለማስላት qmRGA የሚገልጹ ተክሎችን እና pCLV3::mCherry-NLS ግንድ ሴል ዘጋቢ35ን ተጠቅመናል፣ ምክንያቱም L1 የSAM እድገትን በመቆጣጠር ረገድ ቁልፍ ሚና ስለሚጫወት። እዚህ፣ pCLV3::mCherry-NLS አገላለጽ የGA ምልክት እንቅስቃሴን 37 የቦታ-ቴምፖራል ስርጭት ለመተንተን ቋሚ የጂኦሜትሪክ ማጣቀሻ ነጥብ አቅርቧል። GA ለጎን የአካል ክፍሎች እድገት አስፈላጊ እንደሆነ ቢቆጠርም፣ የGA ምልክቶች ከP3 ደረጃ ጀምሮ በአበባ ፕሪሞርዲየም (P) ዝቅተኛ እንደሆኑ አስተውለናል (ምስል 4a፣ b)፣ ወጣት P1 እና P2 ፕሪሞርዲየምዎች ደግሞ በማዕከላዊው ክልል ውስጥ ካለው ጋር ተመሳሳይ የሆነ መካከለኛ እንቅስቃሴ ነበራቸው (ምስል 4a፣ b)። ከፍ ያለ የGA ምልክት እንቅስቃሴ በኦርጋን ፕሪሞርዲየም ወሰኖች ላይ ተገኝቷል፣ ይህም ከP1/P2 (በድንበሩ ጎኖች) ጀምሮ እና በP4 ጫፍ ላይ፣ እንዲሁም በፕሪሞርዲያ መካከል በሚገኙ የፔሪፈራል ክልል ሴሎች ሁሉ (ምስል 4a፣ b እና ተጨማሪ ምስል 8a፣ b) ላይ ተገኝቷል። ይህ ከፍተኛ የGA ምልክት እንቅስቃሴ በኤፒደርሚስ ላይ ብቻ ሳይሆን በL2 እና በላይኛው L3 ንብርብሮችም ላይ ታይቷል (ተጨማሪ ምስል 8b)። በSAM ውስጥ qmRGAን በመጠቀም የተገኙት የGA ምልክቶች ንድፍ በጊዜ ሂደት ሳይለወጥ ቆይቷል (ተጨማሪ ምስል 8c–f፣ k)። ምንም እንኳን qd17mRGA ግንባታ በዝርዝር ከገለጽናቸው አምስት ገለልተኛ መስመሮች በT3 ተክሎች SAM ውስጥ በስርዓት ቢቀንስም፣ በpRPS5a::VENUS-2A-TagBFP ግንባታ የተገኙትን የፍሎረሰንስ ቅጦች መተንተን ችለናል (ተጨማሪ ምስል 8g–j፣ l)። በዚህ የቁጥጥር መስመር ውስጥ፣ በSAM ውስጥ በፍሎረሰንስ ጥምርታ ላይ ጥቃቅን ለውጦች ብቻ ተገኝተዋል፣ ነገር ግን በSAM ማዕከል ውስጥ ከ TagBFP ጋር የተያያዘውን የVENUS ግልጽ እና ያልተጠበቀ መቀነስ አስተውለናል። ይህ በ qmRGA የሚታየው የምልክት ንድፍ የ mRGA-VENUS GA-ጥገኛ መበላሸትን እንደሚያንፀባርቅ ያረጋግጣል፣ ነገር ግን qmRGA በሜሪስቴም ማዕከል ውስጥ የGA ምልክት እንቅስቃሴን ከመጠን በላይ ሊገምት እንደሚችል ያሳያል። ባጭሩ፣ ውጤቶቻችን በዋናነት የፕሪሞርዲያ ስርጭትን የሚያንፀባርቅ የGA ምልክት ንድፍ ያሳያሉ። ይህ የመካከለኛ-ፕሪሞርዲያል ክልል (IPR) ስርጭት የሚከሰተው በማደግ ላይ ባለው ፕሪሞርዲየም እና በማዕከላዊው ክልል መካከል ከፍተኛ የGA ምልክት እንቅስቃሴ ቀስ በቀስ በመቋቋሙ ምክንያት ሲሆን በተመሳሳይ ጊዜ በፕሪሞርዲየም ውስጥ ያለው የGA ምልክት እንቅስቃሴ እየቀነሰ ይሄዳል (ምስል 4c፣ መ)።
የGID1b እና የGID1c ተቀባዮች ስርጭት (ከላይ ይመልከቱ) የGA ተቀባዮች ልዩነት አገላለጽ በSAM ውስጥ የGA ምልክት እንቅስቃሴን ንድፍ ለመቅረጽ እንደሚረዳ ይጠቁማል። የGA ልዩነት ክምችት ሊሳተፍ ይችል እንደሆነ አሰብን። ይህንን እድል ለመመርመር፣ nlsGPS1 GA FRET ዳሳሽ21ን ተጠቅመናል። በ10 μM GA4+7 ለ100 ደቂቃ በታከመው nlsGPS1 SAM ውስጥ የጨመረ የማግበር ድግግሞሽ ተገኝቷል (ተጨማሪ ምስል 9a–e)፣ ይህም nlsGPS1 በSAM ውስጥ ባለው የGA ክምችት ለውጦች ላይ ምላሽ እንደሚሰጥ ያሳያል፣ ልክ እንደ roots21። የnlsGPS1 የማግበር ድግግሞሽ የቦታ ስርጭት በSAM ውጫዊ ንብርብሮች ውስጥ በአንጻራዊ ሁኔታ ዝቅተኛ የGA ደረጃዎችን አሳይቷል፣ ነገር ግን በመሃል እና በSAM ወሰኖች ከፍ ብለው እንደነበሩ አሳይቷል (ምስል 4e እና ተጨማሪ ምስል 9a,c)። ይህ የሚያመለክተው GA በSAM ውስጥ በ qmRGA ከተገለጸው ጋር ተመሳሳይ በሆነ የቦታ ንድፍ ተከፋፍሏል። እንደ ተጨማሪ አቀራረብ፣ SAMን በፍሎረሰንት GA (GA3-፣ GA4-፣ GA7-Fl) ወይም Fl ብቻ እንደ አሉታዊ ቁጥጥር አድርገን ተመልክተነዋል። የFl ምልክት በSAM ውስጥ ተሰራጭቷል፣ ምንም እንኳን ዝቅተኛ ጥንካሬ ቢሆንም (ምስል 4j እና ተጨማሪ ምስል 10d)። በተቃራኒው፣ ሦስቱም GA-Fl በተለይ በፕሪሞርዲየም ድንበሮች ውስጥ እና በቀሪው IPR ውስጥ በተለያዩ ደረጃዎች ተከማችተዋል፣ GA7-Fl በIPR ውስጥ ትልቁ ጎራ ውስጥ ተከማችቷል (ምስል 4k እና ተጨማሪ ምስል 10a,b)። የፍሎረሰንስ ጥንካሬ ብዛቱ እንደሚያሳየው በGA-Fl-በታከመ SAM ውስጥ ከFl-በታከመ SAM ጋር ሲነጻጸር የIPR ወደ IPR ያልሆነ የጥንካሬ ጥምርታ ከፍ ያለ መሆኑን ያሳያል (ምስል 4l እና ተጨማሪ ምስል 10c)። እነዚህ ውጤቶች በአጠቃላይ፣ GA ከኦርጋን ድንበር አጠገብ በሚገኙ የIPR ሴሎች ውስጥ በከፍተኛ ክምችት ውስጥ እንደሚገኝ ይጠቁማሉ። ይህ የሚያሳየው የSAM GA የምልክት እንቅስቃሴ ንድፍ በሁለቱም የGA ተቀባዮች ልዩነት አገላለጽ እና በአካል ክፍሎች ድንበሮች አቅራቢያ ባሉ የIPR ሴሎች ውስጥ የGA ልዩነት ክምችት ውጤት ነው። ስለዚህ፣ የእኛ ትንተና ያልተጠበቀ የGA ምልክት አሰጣጥ ንድፍ አሳይቷል፣ ይህም በSAM መሃል እና ፕሪሞርዲየም ውስጥ ዝቅተኛ እንቅስቃሴ እና በአከባቢ ክልል ውስጥ በIPR ውስጥ ከፍተኛ እንቅስቃሴ ያለው ነው።
በSAM ውስጥ ያለውን የልዩነት GA ምልክት እንቅስቃሴ ሚና ለመረዳት፣ የSAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLSን በእውነተኛ ጊዜ የጊዜ መዘግየት ምስል በመጠቀም በGA ምልክት እንቅስቃሴ፣ በሴል መስፋፋት እና በሴል ክፍፍል መካከል ያለውን ትስስር ተንትነናል። የGA በእድገት ቁጥጥር ውስጥ ያለውን ሚና ከግምት ውስጥ በማስገባት፣ ከሴል መስፋፋት መለኪያዎች ጋር አወንታዊ ትስስር ይጠበቃል። ስለዚህ፣ በመጀመሪያ የGA ምልክት እንቅስቃሴ ካርታዎችን ከሴል ወለል እድገት ፍጥነት ካርታዎች ጋር አነጻጽረናል (ለተወሰነ ሴል እና ለሴት ልጅ ሴሎች ክፍፍል እንደ ተኪ) እና የሴል መስፋፋት አቅጣጫን የሚለካ የእድገት አኒሶትሮፒ ካርታዎችን አነጻጽረናል (እዚህ ላይ ለተሰጠው ሴል እና ለሴት ልጅ ሴሎች ክፍፍል ጥቅም ላይ ውሏል፤ ምስል 5a,b፣ ዘዴዎችን እና ተጨማሪ ዘዴዎችን ይመልከቱ)። የSAM ሴል ወለል እድገት መጠን ካርታዎቻችን ከቀደምት ምልከታዎች38,39 ጋር የሚጣጣሙ ናቸው፣ በድንበር ላይ ዝቅተኛ የእድገት መጠኖች እና በማደግ ላይ ባሉ አበቦች ላይ ከፍተኛ የእድገት መጠኖች (ምስል 5a)። ዋና የክፍል ትንተና (PCA) የGA ምልክት እንቅስቃሴ ከሴል ወለል እድገት ጥንካሬ ጋር አሉታዊ በሆነ መልኩ የተቆራኘ መሆኑን አሳይቷል (ምስል 5c)። በተጨማሪም የGA ምልክት ግብዓት እና የእድገት ጥንካሬን ጨምሮ ዋና ዋና የልዩነት ዘንጎች በከፍተኛ CLV3 አገላለጽ በተወሰነው አቅጣጫ ቀጥ ያሉ መሆናቸውን አሳይተናል፣ ይህም በቀሪዎቹ ትንታኔዎች ውስጥ ከSAM ማዕከል ሴሎች መገለላቸውን ያረጋግጣል። የስፓርማን ትስስር ትንተና የPCA ውጤቶችን አረጋግጧል (ምስል 5d)፣ ይህም በIPR ውስጥ ከፍ ያሉ የGA ምልክቶች ከፍተኛ የሕዋስ መስፋፋት እንዳላመጡ ያሳያል። ሆኖም፣ የተዛመደ ትንተና በGA ምልክት እንቅስቃሴ እና በእድገት አኒሶትሮፒ መካከል ትንሽ አዎንታዊ ትስስር አሳይቷል (ምስል 5c፣ መ)፣ ይህም በIPR ውስጥ ከፍ ያለ የGA ምልክት ማድረጊያ የሕዋስ እድገት አቅጣጫ እና ምናልባትም የሕዋስ ክፍፍል ፕላን አቀማመጥ ላይ ተጽዕኖ እንደሚያሳድር ይጠቁማል።
a, b በSAM ውስጥ ያለው አማካይ የወለል እድገት (a) እና የእድገት አኒሶትሮፒ (b) የሙቀት ካርታዎች በሰባት ገለልተኛ እፅዋት ላይ በአማካይ (በቅደም ተከተል የሕዋስ መስፋፋት ጥንካሬ እና አቅጣጫ ተኪ ሆነው ያገለግላሉ)። c የPCA ትንተና የሚከተሉትን ተለዋዋጮች ያካትታል፡ የGA ምልክት፣ የገጽታ እድገት ጥንካሬ፣ የገጽታ እድገት አኒሶትሮፒ እና የCLV3 አገላለጽ። የPCA ክፍል 1 በዋናነት ከገጽታ እድገት ጥንካሬ ጋር አሉታዊ ግንኙነት ያለው እና ከGA ምልክት ጋር በአዎንታዊ መልኩ የተገናኘ ነበር። የPCA ክፍል 2 በዋናነት ከገጽታ እድገት አኒሶትሮፒ ጋር በአዎንታዊ መልኩ የተገናኘ እና ከCLV3 አገላለጽ ጋር አሉታዊ ግንኙነት ያለው ነበር። መቶኛዎች በእያንዳንዱ አካል የተብራራውን ልዩነት ይወክላሉ። d የGA ምልክት፣ የገጽታ እድገት ጥንካሬ እና የገጽታ እድገት አኒሶትሮፒ መካከል ያለው የSpearman ትስስር ትንተና CZን ሳይጨምር በቲሹ ሚዛን ላይ። በቀኝ በኩል ያለው ቁጥር በሁለት ተለዋዋጮች መካከል ያለው የSpearman rho እሴት ነው። ኮከቦች የጥምረቱ/አሉታዊ ትስስር በጣም ጉልህ የሆኑባቸውን ጉዳዮች ያመለክታሉ። በኮንፎካል ማይክሮስኮፒ የCol-0 SAM L1 ሴሎችን ኢ-ምስል። በ10 ሰዓት ውስጥ በSAM ውስጥ የተፈጠሩ አዳዲስ የሴል ግድግዳዎች እንደ አንግል እሴቶቻቸው ቀለም የተቀቡ ናቸው። የቀለም አሞሌው ከታችኛው ቀኝ ጥግ ላይ ይታያል። ኢንሴቱ ተጓዳኝ የሆነውን የ3-ልኬት ምስል በ0 ሰዓት ያሳያል። ሙከራው ሁለት ጊዜ ተደግሟል እና ተመሳሳይ ውጤቶችን አሳይቷል። የሳጥን ንድፎች በIPR እና IPR ያልሆኑ Col-0 SAM (n = 10 ገለልተኛ ተክሎች) ውስጥ የሴል ክፍፍል መጠኖችን ያሳያሉ። የመሃል መስመሩ መካከለኛውን ያሳያል፣ እና የሳጥኑ ወሰኖች 25ኛውን እና 75ኛውን ፐርሰንታይሎችን ያመለክታሉ። ሹካዎች በR ሶፍትዌር የተወሰኑትን ዝቅተኛውን እና ከፍተኛ እሴቶችን ያመለክታሉ። የP እሴቶች የተገኙት በዌልች ባለ ሁለት ጭራ ቲ-ሙከራ ነው። g፣ h የአዲሱን የሴል ግድግዳ (ማጀንታ) አንግል ከSAM መሃል ካለው ራዲያል አቅጣጫ አንፃር እንዴት እንደሚለካ የሚያሳይ ስዕላዊ ንድፍ (g) ያሳያል (ነጭ ነጠብጣብ መስመር) (አጣዳፊ አንግል እሴቶች ብቻ፣ ማለትም፣ 0-90°፣ ግምት ውስጥ ይገባሉ)፣ እና (h) በሜሪስቴም ውስጥ ያለው ክብ/ጎን እና ራዲያል አቅጣጫዎች። i የሴል ክፍፍል ፕላን አቅጣጫ በSAM (ጥቁር ሰማያዊ)፣ IPR (መካከለኛ ሰማያዊ) እና IPR ያልሆኑ (ቀላል ሰማያዊ) በቅደም ተከተል። የP እሴቶች የተገኙት ባለ ሁለት ጭራ ኮልሞጎሮቭ-ስሚርኖቭ ሙከራ ነው። ሙከራው ሁለት ጊዜ ተደግሟል በተመሳሳይ ውጤቶች። j የIPR የሴል ክፍፍል ፕላን አቅጣጫ የድግግሞሽ ሂስቶግራሞች በP3 (ቀላል አረንጓዴ)፣ P4 (መካከለኛ አረንጓዴ) እና P5 (ጥቁር አረንጓዴ) ዙሪያ በቅደም ተከተል። የP እሴቶች የተገኙት ባለ ሁለት ጭራ ኮልሞጎሮቭ-ስሚርኖቭ ሙከራ ነው። ሙከራው ሁለት ጊዜ ተደግሟል በተመሳሳይ ውጤቶች።
ስለዚህ፣ በምርመራው ወቅት አዲስ የተፈጠሩ የሴል ግድግዳዎችን በመለየት በGA ምልክት እና በሴል ክፍፍል እንቅስቃሴ መካከል ያለውን ትስስር መርምረናል (ምስል 5e)። ይህ አካሄድ የሴል ክፍፍል ድግግሞሽ እና አቅጣጫ እንድንለካ አስችሎናል። በሚገርም ሁኔታ፣ በIPR እና በቀሪው SAM (IPR ያልሆነ፣ ምስል 5f) ውስጥ የሴል ክፍፍል ድግግሞሽ ተመሳሳይ መሆኑን ደርሰንበታል፣ ይህም በIPR እና በIPR ባልሆኑ ሴሎች መካከል ያለው የGA ምልክት ልዩነት በሴል ክፍፍል ላይ ከፍተኛ ተጽዕኖ እንደማያሳድር ያሳያል። ይህ እና በGA ምልክት እና በእድገት አኒሶትሮፒ መካከል ያለው አወንታዊ ትስስር፣ የGA ምልክት እንቅስቃሴ የሴል ክፍፍል አውሮፕላን አቀማመጥ ላይ ተጽዕኖ ሊያሳድር ይችል እንደሆነ እንድናስብ አነሳስቶናል። የአዲሱን የሴል ግድግዳ አቅጣጫ ከሜሪስቴም ማዕከል እና ከአዲሱ የሴል ግድግዳ መሃል ጋር ከሚያገናኘው ራዲያል ዘንግ ጋር በማነፃፀር እንደ አጣዳፊ አንግል ለክተናል (ምስል 5e-i) እና ህዋሶች ከራዲያል ዘንግ ጋር በማነፃፀር እስከ 90° አቅራቢያ ባሉ ማዕዘኖች የመከፋፈል ግልጽ ዝንባሌ ተመልክተናል፣ ከፍተኛው ድግግሞሽ በ70–80° (23.28%) እና 80–90° (22.62%) ታይቷል (ምስል 5e፣i)፣ ይህም በክብ/ትራንስቨርስ አቅጣጫ ውስጥ ካሉ የሴል ክፍሎች ጋር ይዛመዳል (ምስል 5h)። ለዚህ የሴል ክፍፍል ባህሪ የGA ምልክት አስተዋፅዖን ለመመርመር፣ በIPR እና IPR ባልሆኑ የሴል ክፍፍል መለኪያዎች ውስጥ ለየብቻ ተንትነናል (ምስል 5i)። በIPR ሴሎች ውስጥ ያለው የመከፋፈያ አንግል ስርጭት ከIPR ባልሆኑ ሴሎች ወይም በጠቅላላው SAM ውስጥ ባሉ ሴሎች ውስጥ ካለው የተለየ መሆኑን ተመልክተናል፣ የIPR ሴሎች ከፍተኛ መጠን ያለው የጎን/ክብ ሴል ክፍሎች ያሳያሉ፣ ማለትም ከ70–80° እና 80–90° (33.86% እና 30.71% በቅደም ተከተል፣ ተጓዳኝ መጠኖች) (ምስል 5i)። ስለዚህ፣ ምልከታዎቻችን በከፍተኛ የGA ምልክት ማድረጊያ እና ከክብ አቅጣጫ አቅራቢያ ባለ የሴል ክፍፍል ፕላን አቅጣጫ መካከል ያለውን ግንኙነት አሳይተዋል፣ ይህም በGA ምልክት እንቅስቃሴ እና በእድገት አኒሶትሮፒ መካከል ካለው ትስስር ጋር ተመሳሳይ ነው (ምስል 5c፣ መ)። የዚህን ትስስር የቦታ ጥበቃ የበለጠ ለማረጋገጥ፣ ከP3 ጀምሮ በፕሪሞርዲየም ዙሪያ ባሉ የIPR ሴሎች ውስጥ ያለውን የመከፋፈያ ፕላን አቅጣጫ ለክንተናል፣ ምክንያቱም በዚህ ክልል ውስጥ ከፍተኛው የGA ምልክት እንቅስቃሴ ከP4 ጀምሮ ተገኝቷል (ምስል 4)። በP3 እና P4 ዙሪያ ያሉት የIPR የመከፋፈያ ማዕዘኖች በስታቲስቲክስ ጉልህ የሆኑ ልዩነቶች አላሳዩም፣ ምንም እንኳን በP4 ዙሪያ ባለው የIPR ውስጥ የጎን ሴል ክፍሎች ድግግሞሽ ቢጨምርም (ምስል 5j)። ይሁን እንጂ፣ በP5 ዙሪያ ባሉ የIPR ሴሎች ውስጥ፣ የሴል ክፍፍል ፕላን አቅጣጫ ልዩነት በስታቲስቲክስ ደረጃ ጉልህ ሆኗል፣ ይህም የሽግግር ሴል ክፍፍል ድግግሞሽ በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል (ምስል 5j)። እነዚህ ውጤቶች አንድ ላይ ሲታዩ፣ የGA ምልክት በSAM ውስጥ የሴል ክፍፍል አቅጣጫን መቆጣጠር እንደሚችል ይጠቁማሉ፣ ይህም ከፍተኛ የGA ምልክት በIPR ውስጥ የሴል ክፍፍል ጎን አቅጣጫን ሊያመጣ እንደሚችል ከቀደሙት ሪፖርቶች40,41 ጋር የሚስማማ ነው።
በIPR ውስጥ ያሉ ሴሎች ወደ ፕሪሞርዲያ ውስጥ እንደማይገቡ ይገመታል፤ ይልቁንም ወደ ኢንተርኖድስ2፣42፣43 ውስጥ እንደሚገቡ ይገመታል። በIPR ውስጥ ያሉ የሴል ክፍፍሎች ተሻጋሪ አቅጣጫ በኢንተርኖዶች ውስጥ ያሉ የኤፒደርማል ሴሎች ትይዩ ቁመታዊ ረድፎችን መደበኛ አደረጃጀት ሊያስከትል ይችላል። ከላይ የተገለጹት ምልከታዎቻችን እንደሚያሳዩት የጂኤ ምልክት የሴል ክፍፍል አቅጣጫን በመቆጣጠር በዚህ ሂደት ውስጥ ሚና ይጫወታል።
የበርካታ የDELLA ጂኖች ተግባር ማጣት የተዋሃደ የGA ምላሽ ያስከትላል፣ እና የዴላ ሚውቴሽን ይህንን መላምት ለመፈተሽ ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል44። በመጀመሪያ በSAM ውስጥ የአምስት DELLA ጂኖች አገላለጽ ቅጦችን ተንትነናል። የGUS መስመር45 ግልባጭ ውህደት GAI፣ RGA፣ RGL1 እና RGL2 (በጣም በትንሹ) በSAM ውስጥ እንደተገለጹ አሳይቷል (ተጨማሪ ምስል 11a–d)። In situ hybridization በተጨማሪ GAI mRNA በተለይ በፕሪሞርዲያ እና በማደግ ላይ ባሉ አበቦች ውስጥ እንደሚከማች አሳይቷል (ተጨማሪ ምስል 11e)። RGL1 እና RGL3 mRNA በSAM ሸራ እና በአሮጌ አበቦች ውስጥ ተገኝተዋል፣ RGL2 mRNA ደግሞ በድንበር ክልል ውስጥ የበለጠ የበዛ ነበር (ተጨማሪ ምስል 11f–h)። የpRGL3::RGL3-GFP SAM ኮንፎካል ምስል በ in situ hybridization የታየውን አገላለጽ አረጋግጧል እና RGL3 ፕሮቲን በSAM ማዕከላዊ ክፍል ውስጥ እንደሚከማች አሳይቷል (ተጨማሪ ምስል 11i)። የpRGA::GFP-RGA መስመርን በመጠቀም፣ የRGA ፕሮቲን በSAM ውስጥ እንደሚከማች ደርሰንበታል፣ ነገር ግን ከP4 ጀምሮ ያለው ብዛት በድንበር ላይ ይቀንሳል (ተጨማሪ ምስል 11j)። በተለይም፣ የRGL3 እና RGA የመግለፅ ቅጦች በ qmRGA እንደተገኘው በIPR ውስጥ ካለው ከፍተኛ የGA ምልክት እንቅስቃሴ ጋር የሚጣጣሙ ናቸው (ምስል 4)። ከዚህም በላይ፣ እነዚህ መረጃዎች ሁሉም DELLAዎች በSAM ውስጥ እንደሚገለጹ እና አገላለጻቸው በአጠቃላይ መላውን SAM እንደሚሸፍን ያመለክታሉ።
ቀጥሎም በዱር-አይነት SAM (Ler, control) እና gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) ሚውቴሽን ውስጥ ያሉትን የሴል ዲቪዥን መለኪያዎች ተንትነናል (ምስል 6a፣ ለ)። የሚገርመው ነገር፣ በዴላ ግሎባል ሚውቴሽን SAM ውስጥ ከዱር አይነት ጋር ሲነጻጸር የሴል ዲቪዥን አንግል ድግግሞሾች ስርጭት ላይ በስታቲስቲክስ ጉልህ የሆነ ለውጥ አስተውለናል (ምስል 6c)። ይህ በዴላ ግሎባል ሚውቴሽን ላይ የተደረገው ለውጥ የተከሰተው በ80–90° ማዕዘኖች ድግግሞሽ (34.71% ከ24.55%) እና በትንሹም ቢሆን ከ70–80° ማዕዘኖች (23.78% ከ20.18%) በመጨመር ነው፣ ማለትም ከትራንስቨርስ ሴል ዲቪዥኖች ጋር የሚዛመድ (ምስል 6c)። የትራንስቨርስ ያልሆኑ ዲቪዥኖች ድግግሞሽ (0–60°) በዴላ ግሎባል ሚውቴሽን ውስጥም ዝቅተኛ ነበር (ምስል 6c)። የዴላ ግሎባል ሚውታንት SAM (ምስል 6ለ) ውስጥ የትራንስቨር ሴል ዲቪዥኖች ድግግሞሽ በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል። በ IPR ውስጥ የትራንስቨር ሴል ዲቪዥኖች ድግግሞሽ ከዱር ዓይነት ጋር ሲነጻጸር በዴላ ግሎባል ሚውታንት ውስጥም ከፍ ያለ ነበር (ምስል 6መ)። ከ IPR ክልል ውጭ፣ የዱር ዓይነት የሴል ዲቪዥን ማዕዘኖች የበለጠ ወጥ የሆነ ስርጭት ነበረው፣ የዴላ ግሎባል ሚውታንት ደግሞ እንደ IPR ያሉ ታንጀንሻል ዲቪዥኖችን ይመርጣል (ምስል 6e)። እንዲሁም GA የሚከማችበት የGA-እንቅስቃሴ-አልባ ሚውታንት ዳራ የሆነውን የGA2 ኦክሲዳሴ (ga2ox1-1፣ ga2ox2-1፣ ga2ox3-1፣ ga2ox4-1 እና ga2ox6-2) የሴል ዲቪዥኖችን አቅጣጫ ለካን። ከጂኤ ደረጃዎች መጨመር ጋር በሚስማማ መልኩ፣ የኩዊንቱፕል ጋ2ኦክስ ሚውቴሽን ኢንፍላሜሽን SAM ከኮል-0 (ተጨማሪ ምስል 12a፣ b) የበለጠ ነበር፣ እና ከኮል-0 ጋር ሲነጻጸር፣ የኩዊንቱፕል ጋ2ኦክስ SAM የሴል ክፍፍል ማዕዘኖች በግልጽ የተለየ ስርጭት አሳይቷል፣ የአንግል ድግግሞሽ ከ50° ወደ 90° ይጨምራል፣ ማለትም እንደገና የታንጀንሻል ክፍሎችን ይደግፋል (ተጨማሪ ምስል 12a–c)። ስለዚህ፣ የጂኤ ምልክት ማድረጊያ እና የጂኤ ክምችት መዋቅራዊ ማግበር በIPR እና በቀሪው የጂኤኤም ውስጥ የጎን ሴል ክፍሎችን እንደሚያመጣ እናሳያለን።
a, b የ PI-የተቀባ Ler (a) እና ግሎባል ዴላ ሚውቴሽን (b) SAM L1 ንብርብር ኮንፎካል ማይክሮስኮፒ በመጠቀም የ3D ምስላዊ እይታ። በ10-ሰዓት ጊዜ ውስጥ በSAM (ግን ፕሪሞርዲየም አይደለም) ውስጥ የተፈጠሩ አዳዲስ የሴል ግድግዳዎች እንደ አንግል እሴቶቻቸው ይታያሉ እና ቀለም የተቀቡ ናቸው። ኢንሴቱ SAM በ0 ሰዓት ያሳያል። የቀለም አሞሌው በታችኛው ቀኝ ጥግ ላይ ይታያል። በ (b) ውስጥ ያለው ቀስት በአለም አቀፍ ዴላ ሚውቴሽን ውስጥ የተጣጣሙ የሴል ፋይሎች ምሳሌን ያሳያል። ሙከራው ሁለት ጊዜ ተደግሟል እና ተመሳሳይ ውጤቶች አሉት። በሌር እና በአለም አቀፍ ዴላ መካከል ባለው የሴል ክፍፍል ፕላን አቅጣጫዎች የድግግሞሽ ስርጭት ce ንፅፅር። የP እሴቶች የተገኙት ባለ ሁለት ጭራ ኮልሞጎሮቭ-ስሚርኖቭ ሙከራ በመጠቀም ነው። f, g የ PI-የተቀባ SAM Col-0 (i) እና pCUC2::gai-1-VENUS (j) ትራንስጀኒክ ተክሎች የኮንፎካል ምስሎች 3D ምስላዊ እይታ። ፓነሎች (a, b) በ10 ሰዓታት ውስጥ በSAM ውስጥ የተፈጠሩ አዳዲስ የሴል ግድግዳዎችን (ግን ፕሪሞርዲያ አይደለም) ያሳያሉ። ሙከራው ሁለት ጊዜ ተደግሟል እና ተመሳሳይ ውጤቶችን አስገኝቷል። h–j በCol-0 እና pCUC2::gai-1-VENUS ተክሎች መካከል በጠቅላላው SAM (h)፣ IPR (i) እና IPR ያልሆነ (j) ውስጥ የሚገኙትን የሴል ክፍፍል ፕላን አቅጣጫዎች የድግግሞሽ ስርጭት ንጽጽር። የP እሴቶች የተገኙት ባለ ሁለት ጭራ ኮልሞጎሮቭ-ስሚርኖቭ ሙከራን በመጠቀም ነው።
ቀጥሎም በተለይ በIPR ውስጥ የGA ምልክትን የመከልከልን ውጤት ሞክረናል። ለዚህም፣ ከVENUS ጋር የተዋሃደውን የበላይነት ያለው አሉታዊ gai-1 ፕሮቲን (በpCUC2::gai-1-VENUS መስመር) ለመግለጽ የኮቲሌደን ኩባያ 2 (CUC2) ፕሮሞተርን ተጠቅመናል። በዱር-ዓይነት SAM ውስጥ፣ CUC2 ፕሮሞተር ከP4 ጀምሮ በSAM ውስጥ ያሉትን አብዛኛዎቹን IPRዎች፣ የድንበር ሴሎችን ጨምሮ፣ አገላለጽን ያነሳሳል፣ እና ተመሳሳይ ልዩ አገላለጽ በpCUC2::gai-1-VENUS ተክሎች ውስጥ ታይቷል (ከታች ይመልከቱ)። በpCUC2::gai-1-VENUS ተክሎች SAM ወይም IPR ላይ የሴል ክፍፍል ማዕዘኖች ስርጭት ከዱር ዓይነት በእጅጉ የተለየ አልነበረም፣ ምንም እንኳን ባልተጠበቀ ሁኔታ በእነዚህ ተክሎች ውስጥ IPR የሌላቸው ሴሎች በከፍተኛ ድግግሞሽ ከ80–90° እንደተከፋፈሉ ደርሰንበታል (ምስል 6f–j)።
የሴል ክፍፍል አቅጣጫ በSAM ጂኦሜትሪ ላይ የተመሰረተ እንደሆነ ተጠቁሟል፣ በተለይም በቲሹ ኩርባ46 የተፈጠረውን የመለጠጥ ውጥረት። ስለዚህ የSAM ቅርፅ በዴላ ግሎባል ሚውታንት እና pCUC2::gai-1-VENUS ተክሎች ውስጥ ተቀይሮ እንደሆነ ጠይቀናል። ቀደም ሲል እንደተገለጸው12፣ የዴላ ግሎባል ሚውታንት SAM መጠን ከዱር ዓይነት የበለጠ ነበር (ተጨማሪ ምስል 13a፣ b፣ d)። የCLV3 እና STM RNA በሲቱ ሃይብሪዲዜሽን በዴላ ሚውታንት ውስጥ የሜሪስቴም መስፋፋትን አረጋግጧል እና የስቴም ሴል ኒኬር የጎን መስፋፋትንም አሳይቷል (ተጨማሪ ምስል 13e፣ f፣ h፣ i)። ሆኖም፣ የSAM ኩርባ በሁለቱም ጂኖታይፖች ተመሳሳይ ነበር (ተጨማሪ ምስል 13k፣ m፣ n፣ p)። ከዱር ዓይነት ጋር ሲነጻጸር በ gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 ዴላ ባለአራት እጥፍ ሚውቴሽን ውስጥ ተመሳሳይ የመጠን ጭማሪ አስተውለናል (ተጨማሪ ምስል 13c፣ d፣ g፣ j፣ l፣ o፣ p)። የሴል ክፍፍል አቅጣጫ ድግግሞሽ በዴላ ባለአራት እጥፍ ሚውቴሽን ውስጥም ተጎድቷል፣ ነገር ግን ከዴላ ሞኖሊቲክ ሚውቴሽን ጋር ሲነጻጸር ባነሰ መጠን (ተጨማሪ ምስል 12d–f)። ይህ የመጠን ውጤት፣ ከመጠምዘዝ ጋር፣ በዴላ ባለአራት እጥፍ ሚውቴሽን ላይ ያለው ቀሪ RGL3 እንቅስቃሴ በዲኤልኤ እንቅስቃሴ መጥፋት ምክንያት የሚከሰተውን የሴል ክፍፍል አቅጣጫ ለውጦችን እንደሚገድብ እና በጎን የሴል ክፍሎች ላይ የሚደረጉ ለውጦች በSAM ጂኦሜትሪ ላይ ከሚደረጉ ለውጦች ይልቅ በGA ምልክት እንቅስቃሴ ለውጦች ምላሽ እንደሚሰጡ ይጠቁማል። ከላይ እንደተገለጸው፣ የCUC2 ፕሮሞተር በSAM ውስጥ የIPR አገላለጽን ከP4 ጀምሮ ያንቀሳቅሳል (ተጨማሪ ምስል 14a፣ b)፣ እና በተቃራኒው፣ pCUC2::gai-1-VENUS SAM መጠኑ ቀንሷል ነገር ግን ከፍ ያለ ኩርባ ነበረው (ተጨማሪ ምስል 14c–h)። ይህ በpCUC2::gai-1-VENUS SAM ሞርፎሎጂ ላይ የተደረገው ለውጥ ከዱር ዓይነት ጋር ሲነጻጸር የተለየ የሜካኒካል ጭንቀቶች ስርጭት ሊያስከትል ይችላል፣ በዚህ ውስጥ ከፍተኛ የዙሪያ ጭንቀቶች ከSAM ማዕከል47 በአጭር ርቀት ይጀምራሉ። በአማራጭ፣ በpCUC2::gai-1-VENUS SAM ሞርፎሎጂ ላይ የተደረጉ ለውጦች በትራንስጂን አገላለጽ48 ምክንያት በተከሰቱ የክልል ሜካኒካል ባህሪያት ለውጦች ምክንያት ሊከሰቱ ይችላሉ። በሁለቱም ሁኔታዎች፣ ይህ በGA ምልክት ላይ የተደረጉ ለውጦች ውጤቶችን በከፊል በማካካስ ምልከታዎቻችንን በማብራራት ሴሎች በክልል/ትራንስቨርስ አቅጣጫ የመከፋፈል እድላቸውን ከፍ ሊያደርግ ይችላል።
አንድ ላይ ተዳምሮ፣ የእኛ መረጃዎች እንደሚያሳዩት ከፍተኛ የጂኤ ሲግናል በIPR ውስጥ ባለው የሴል ዲቪዥን ፕላን ጎን ለጎን አቅጣጫ ላይ ንቁ ሚና ይጫወታል። በተጨማሪም የሜሪስቴም ኩርባ በIPR ውስጥ ባለው የሴል ዲቪዥን ፕላን አቅጣጫ ላይ ተጽዕኖ ያሳድራል።
በIPR ውስጥ ያለው የዲቪዥን ፕላን ተሻጋሪ አቅጣጫ፣ በከፍተኛ የGA ምልክት እንቅስቃሴ ምክንያት፣ GA በSAM ውስጥ ባለው epidermis ውስጥ የራዲያል ሴል ፋይልን አስቀድሞ በማደራጀት በኋላ ላይ በኤፒደርማል ኢንተርኖድ ውስጥ የሚገኘውን የሴሉላር አደረጃጀትን ይገልጻል። በእርግጥም፣ እንደዚህ ያሉ የሴል ፋይሎች በዴላ ግሎባል ሚውቴሽንስ የSAM ምስሎች ውስጥ በተደጋጋሚ ይታያሉ (ምስል 6ለ)። ስለዚህ፣ በSAM ውስጥ የGA ምልክት ማድረጊያ የቦታ ንድፍ የእድገት ተግባርን የበለጠ ለማሰስ፣ በዱር-አይነት (Ler and Col-0)፣ በዴላ ግሎባል ሚውቴሽንስ እና በpCUC2::gai-1-VENUS ትራንስጀኒክ ተክሎች ውስጥ ያሉትን የሕዋሳት የቦታ አደረጃጀት ለመተንተን የጊዜ-ጊዜ ምስልን ተጠቅመናል።
qmRGA በIPR ውስጥ ያለው የGA ምልክት እንቅስቃሴ ከP1/P2 እንደጨመረ እና በP4 ጫፍ ላይ እንደደረሰ እንዳሳየ ደርሰንበታል፣ እና ይህ ንድፍ በጊዜ ሂደት ቋሚ ሆኖ ቀጥሏል (ምስል 4a–f እና ተጨማሪ ምስል 8c–f፣ k)። በIPR ውስጥ የሕዋሶችን የቦታ አደረጃጀት በGA ምልክት እየጨመረ በመምጣቱ ለመተንተን፣ በልማት እጣ ፈንታቸው መሠረት ከላይ እና በP4 ጎኖች ላይ የLer IPR ሴሎችን መለያ አድርገን ነበር፣ ማለትም፣ ከሁለት የፕላስቲድ ጊዜ በላይ፣ ይህም ከP1/P2 እስከ P4 ባለው የፕሪሞርዲየም እድገት ወቅት የIPR ሴሎችን እንድንከተል አስችሎናል። ሶስት የተለያዩ ቀለሞችን ተጠቅመናል፡- በP4 አቅራቢያ ባለው ፕሪሞርዲየም ውስጥ ለተዋሃዱት ሴሎች ቢጫ፣ በIPR ውስጥ ላሉት አረንጓዴ እና በሁለቱም ሂደቶች ውስጥ ለተሳተፉት ሐምራዊ (ምስል 7a–c)። በt0 (0 h)፣ 1–2 የIPR ሴሎች ንብርብሮች በP4 ፊት ይታያሉ (ምስል 7a)። እንደተጠበቀው፣ እነዚህ ሴሎች ሲከፋፈሉ፣ በዋናነት በትራንስቨርስ ዲቪዥን ፕላን በኩል ያደርጉ ነበር (ምስል 7a–c)። ተመሳሳይ ውጤቶች የተገኙት በCol-0 SAM (በLer ውስጥ ካለው P4 ጋር ተመሳሳይ በሆነው P3 ላይ በማተኮር) በመጠቀም ነው፣ ምንም እንኳን በዚህ የጂኖታይፕ የአበባ ድንበር ላይ የተፈጠረው እጥፋት የIPR ሴሎችን በፍጥነት ደብቆታል (ምስል 7g–i)። ስለዚህ፣ የIPR ሴሎች የመከፋፈል ንድፍ ሴሎችን ወደ ራዲያል ረድፎች ቀድመው ያደራጃቸዋል፣ ልክ እንደ ኢንተርኖዶች። የራዲያል ረድፎች አደረጃጀት እና በተከታታይ አካላት መካከል የIPR ሴሎች አካባቢያዊነት እነዚህ ሴሎች የኢንተርኖዳል ቅድመ-ወሊዶች መሆናቸውን ይጠቁማል።
እዚህ፣ ጥምር የGA እና የGA ተቀባይ ክምችትን በመቀነስ እና በኢንዶጅናል ሲግናል መንገዶች ላይ ጣልቃ ገብነትን በመቀነስ በሴሉላር ደረጃ ስለ GA ተግባር መረጃ የሚሰጥ የGA ምልክት እንቅስቃሴን መጠናዊ ካርታ (quantitative mapping) የሚፈቅድ የራቲዮሜትሪክ GA ምልክት ማድረጊያ ባዮሴንሰር፣ qmRGA አዘጋጅተናል። ለዚህም፣ የተሻሻለ የDELLA ፕሮቲን፣ mRGA፣ ገንብተናል፣ ይህም የDELLA መስተጋብር አጋሮችን የማሰር ችሎታውን አጥቷል ነገር ግን ለGA-የተፈጠረ ፕሮቲዮሊሲስ ስሜታዊ ሆኖ ይቆያል። qmRGA በGA ደረጃዎች ውስጥ ለሚከሰቱ ውጫዊ እና ውስጣዊ ለውጦች ምላሽ ይሰጣል፣ እና ተለዋዋጭ ዳሰሳ ባህሪያቱ በልማት ወቅት በGA ምልክት እንቅስቃሴ ውስጥ የቦታ-ቴምፖራል ለውጦችን ለመገምገም ያስችላሉ። qmRGA እንዲሁም በጣም ተለዋዋጭ መሳሪያ ነው ምክንያቱም ለመግለፅ ጥቅም ላይ የዋለውን ፕሮሞተር በመቀየር (አስፈላጊ ከሆነ) ለተለያዩ ሕብረ ሕዋሳት ሊስማማ ስለሚችል፣ እና የGA ምልክት መንገድ እና የPFYRE ሞቲፍ በአንጂዮስፐርም ላይ ያለውን የተጠበቀ ባህሪ ከግምት ውስጥ በማስገባት፣ ወደ ሌሎች ዝርያዎች22 ሊተላለፍ ይችላል። ከዚህ ጋር በሚስማማ መልኩ፣ በሩዝ SLR1 DELLA ፕሮቲን (HYY497AAA) ውስጥ ያለው ተመጣጣኝ ሚውቴሽን የSLR1 የእድገት ተከላካይ እንቅስቃሴን በመግታት ከ mRGA23 ጋር ተመሳሳይ በሆነ የGA-መካከለኛ መበላሸት በትንሹ እንደሚቀንስ ታይቷል። በተለይም፣ በአራቢዶፕሲስ የተደረጉ የቅርብ ጊዜ ጥናቶች እንደሚያሳዩት በPFYRE ጎራ (S474L) ውስጥ ያለ አንድ አሚኖ አሲድ ሚውቴሽን የRGA የትራንስክሪፕሽን እንቅስቃሴን ከትራንስክሪፕሽን ፋክተር አጋሮች50 ጋር የመገናኘት ችሎታውን ሳይጎዳ ቀይሮታል። ምንም እንኳን ይህ ሚውቴሽን በ mRGA ውስጥ ካሉት 3 አሚኖ አሲድ ምትክዎች ጋር በጣም ቅርብ ቢሆንም፣ ጥናቶቻችን እንደሚያሳዩት እነዚህ ሁለት ሚውቴሽኖች የDELLA የተለያዩ ባህሪያትን ይለውጣሉ። ምንም እንኳን አብዛኛዎቹ የትራንስክሪፕሽን ፋክተር አጋሮች ከDELLA26,51 LHR1 እና SAW ጎራዎች ጋር ቢጣመሩም፣ በPFYRE ጎራ ውስጥ ያሉ አንዳንድ የተጠበቁ አሚኖ አሲዶች እነዚህን መስተጋብሮች ለማረጋጋት ሊረዱ ይችላሉ።
የኢንተርኖድ እድገት በእፅዋት አርክቴክቸር እና በምርት ማሻሻያ ውስጥ ቁልፍ ባህሪ ነው። qmRGA በIPR internode ፕሮጄንተሪ ሴሎች ውስጥ ከፍተኛ የGA ምልክት እንቅስቃሴን አሳይቷል። የቁጥር ምስል እና የጄኔቲክስን በማጣመር፣ የGA ምልክት ቅጦች በSAM epidermis ውስጥ ክብ/ትራንስቨርስ ሴል ክፍፍል አውሮፕላኖችን እንደሚያሳድጉ አሳይተናል፣ ይህም ለኢንተርኖድ ልማት የሚያስፈልገውን የሴል ክፍፍል አደረጃጀት እንደሚቀርጽ አሳይተናል። በልማት ወቅት በርካታ የሴል ክፍፍል ፕላን አቅጣጫ ተቆጣጣሪዎች ተለይተዋል። ስራችን የGA ምልክት እንቅስቃሴ ይህንን የሴሉላር መለኪያ እንዴት እንደሚቆጣጠር ግልጽ ምሳሌ ይሰጣል። DELLA ከቅድመ-ታጣፊ የፕሮቲን ውህዶች41 ጋር መስተጋብር ሊፈጥር ይችላል፣ ስለዚህ የGA ምልክት የሴል ክፍፍል ፕላን አቅጣጫን በቀጥታ በመነካካት የሴል ክፍፍል ፕላን አቅጣጫን ሊቆጣጠር ይችላል40,41,54,55። በSAM ውስጥ፣ የከፍተኛ የGA ምልክት እንቅስቃሴ ትስስር የሴል ማራዘም ወይም መከፋፈል ሳይሆን የእድገት አኒሶትሮፒ ብቻ መሆኑን ሳይታሰብ አሳይተናል፣ ይህም በIPR ውስጥ የGA ቀጥተኛ የሴል ክፍፍል አቅጣጫ ላይ ካለው ቀጥተኛ ተጽእኖ ጋር የሚጣጣም ነው። ሆኖም፣ ይህ ውጤት ቀጥተኛ ያልሆነ ሊሆን እንደሚችል ማስቀረት አንችልም፣ ለምሳሌ በGA ምክንያት በሴል ግድግዳ ማለስለሻ የተደገፈ56። በሴል ግድግዳ ባህሪያት ላይ የሚደረጉ ለውጦች ሜካኒካል ውጥረትን ያስከትላሉ57,58፣ ይህም የኮርቲካል ማይክሮቱቡሎች አቅጣጫን በመነካካት የሴል ክፍፍል ፕላን አቅጣጫን ሊጎዳ ይችላል39,46,59። በGA የሚፈጠረው የሜካኒካል ውጥረት እና በGA የሚፈጠረው የማይክሮቱቡል አቅጣጫ ቀጥተኛ ቁጥጥር ጥምረት ውጤቶች በIPR ውስጥ ኢንተርኖዶችን ለመግለጽ የተወሰነ የሴል ክፍፍል አቅጣጫን በመፍጠር ላይ ሊሳተፉ ይችላሉ፣ እና ይህንን ሀሳብ ለመፈተሽ ተጨማሪ ጥናቶች ያስፈልጋሉ። በተመሳሳይ፣ ቀደም ሲል የተደረጉ ጥናቶች የDELLA-interactive ፕሮቲኖች TCP14 እና 15 በኢንተርኖድ ምስረታ 60,61 ቁጥጥር ውስጥ ያለውን አስፈላጊነት አጉልተው አሳይተዋል፣ እና እነዚህ ምክንያቶች የኢንተርኖድ እድገትን የሚቆጣጠሩ እና የGA ምልክትን2,62 ላይ ተጽዕኖ እንደሚያሳድሩ ታይተዋል፣ እነዚህም የGA እርምጃን ከBREVIPEDICELLUS (BP) እና PENNYWISE (PNY) ጋር ሊያስተባብሉ ይችላሉ። DELLAዎች ከብራሲኖስቴሮይድ፣ ኤቲሊን፣ ጃስሞኒክ አሲድ እና የሆድ አሲድ (ABA) የምልክት መንገዶች63,64 ጋር ስለሚገናኙ እና እነዚህ ሆርሞኖች የማይክሮቱቡል አቅጣጫን ላይ ተጽዕኖ ሊያሳድሩ ስለሚችሉ፣ የGA ተጽእኖዎች በሌሎች ሆርሞኖችም ሊተላለፉ ይችላሉ።
ቀደምት የሳይቶሎጂ ጥናቶች እንደሚያሳዩት የአረብቢዶፕሲስ SAM ውስጣዊም ሆነ ውጫዊ ክልሎች ለኢንተርኖድ ልማት አስፈላጊ ናቸው2,42። GA በውስጠኛው ሕብረ ሕዋሳት ውስጥ የሕዋስ ክፍፍልን በንቃት መቆጣጠሩ በSAM ውስጥ የሜሪስቴም እና የኢንተርኖድ መጠንን በመቆጣጠር የGA ድርብ ተግባርን ይደግፋል። የአቅጣጫ ሴል ክፍፍል ንድፍ በውስጠኛው የSAM ሕብረ ሕዋስ ውስጥም በጥብቅ ቁጥጥር ይደረግበታል፣ እና ይህ ደንብ ለግንዱ እድገት52 አስፈላጊ ነው። GA በውስጠኛው የSAM ድርጅት ውስጥ የሕዋስ ክፍፍል አውሮፕላንን በማነጣጠር ረገድ ሚና ይጫወታል ወይ የሚለውን መመርመር አስደሳች ይሆናል፣ በዚህም በSAM ውስጥ የኢንተርኖዶችን ዝርዝር መግለጫ እና ልማት ያመሳስላል።
ተክሎች በአፈር ውስጥ በብልቃጥ ውስጥ ወይም 1x ሙራሺጌ-ስኩግ (ኤምኤስ) መካከለኛ (ዱቼፋ) በመደበኛ ሁኔታዎች (16 ሰዓት ብርሃን፣ 22 °ሴ) በ1% ሱክሮስ እና 1% አጋር (ሲግማ) በተጨመሩበት በ1% ሱክሮስ እና 1% አጋር (ሲግማ) በተጨመሩበት በ22 °ሴ (16 ሰዓት ብርሃን፣ 22 °ሴ) የተተከሉ ሲሆን ችግኞች ቀጥ ባሉ ሳህኖች ላይ በቋሚ ብርሃን እና 22 °ሴ የተተከሉባቸው የስር እድገት ሙከራዎች ሳይቀሩ። ለናይትሬት ሙከራዎች፣ ተክሎች በረጅም ቀን ሁኔታዎች ውስጥ በቂ ናይትሬት (0 ወይም 10 mM KNO3)፣ 0.5 mM NH4-ሱቺኔት፣ 1% ሱክሮስ እና 1% A-agar (ሲግማ) በተጨመሩበት በተሻሻለው የኤምኤስ መካከለኛ (ባዮዎርልድ የእፅዋት መካከለኛ) ላይ ይበቅላሉ።
በpDONR221 ውስጥ የገባው GID1a cDNA ከpDONR P4-P1R-pUBQ10 እና pDONR P2R-P3-mCherry ጋር ወደ pB7m34GW እንደገና ተጣምሮ pUBQ10::GID1a-mCherry እንዲፈጠር ተደርጓል። በpDONR221 ውስጥ የገባው IDD2 ዲኤንኤ p35S:IDD2-RFP ለማመንጨት ወደ pB7RWG266 እንደገና ተጣምሯል። pGID1b::2xmTQ2-GID1b ለማመንጨት፣ የGID1b ኮድ ክልል 3.9 kb ክፍልፋይ እና የGID1b cDNA (1.3 kb) እና ተርሚናተር (3.4 kb) የያዘ 4.7 kb ክፍልፋይ በመጀመሪያ በማሟያ ሠንጠረዥ 3 ውስጥ ያሉትን ፕሪመሮች በመጠቀም አጉልተው ታይተዋል እና ከዚያም በቅደም ተከተል በpDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) እና pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) ውስጥ ገብተዋል፣ እና በመጨረሻም በጌትዌይ ክሎኒንግ በመጠቀም ከpDONR221 2xmTQ268 ጋር በpGreen 012567 ኢላማ ቬክተር ውስጥ እንደገና ተቀላቅለዋል። pCUC2::LSSmOrange ለማመንጨት፣ የCUC2 ፕሮሞተር ቅደም ተከተል (ከATG ጅረት በላይ 3229 bp) እና በመቀጠልም የትልቅ ስቶክስ-ሺፍትድ mOrange (LSSmOrange)69 የኮድ ቅደም ተከተል ከN7 ኒውክሊየር ሎካላይዜሽን ምልክት ጋር እና የNOS ትራንስክሪፕሽን ተርሚናተር በጌትዌይ 3-ፍራክመንት ሪኮምቢኔሽን ሲስተም (Invitrogen) በመጠቀም በpGreen ካናሚሲን ኢላማ ቬክተር ውስጥ ተሰብስበዋል። የእፅዋት ሁለትዮሽ ቬክተር ወደ አግሮባክቴሪየም ቱሜፋሲየንስ ዝርያ GV3101 ተዋውቆ በአግሮባክቴሪየም ሰርጎ ገብ ዘዴ እና በአረብዲፖሲስ ታልያና ኮል-0 በቅደም ተከተል አስተዋውቋል። pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry እና pCLV3::mCherry-NLS qmRGA ከየራሳቸው መስቀሎች F3 እና F1 ዘሮች ተለይተዋል።
አር ኤን ኤ በቦታ ውስጥ ያለው ሃይብሪዴሽን በግምት 1 ሴ.ሜ ርዝመት ባለው የተኩስ ጫፍ72 ላይ ተካሂዷል፣ እነዚህም ተሰብስበው ወዲያውኑ በFAA መፍትሄ (3.7% ፎርማልዴይድ፣ 5% አሴቲክ አሲድ፣ 50% ኤታኖል) ውስጥ ቀድሞ ወደ 4 °ሴ ተስተካክለዋል። ከ2 × 15 ደቂቃ የቫክዩም ህክምና በኋላ፣ ፊክአቬቲቭ ተቀይሮ ናሙናዎቹ በአንድ ሌሊት እንዲቀዘቅዙ ተደርጓል። GID1a፣ GID1b፣ GID1c፣ GAI፣ RGL1፣ RGL2 እና RGL3 cDNAዎች እና ለ3′-UTRዎቻቸው አንቲሴንስ መመርመሪያዎች በሮዚየር እና ሌሎች 73 እንደተገለፀው በተጨማሪ ሠንጠረዥ 3 ላይ በተገለጹት ፕሪመሮች በመጠቀም ተዋህደዋል። በዲጎክሲጀኒን መለያ የተሰጣቸው መመርመሪያዎች በዲጎክሲጀኒን ፀረ እንግዳ አካላት (3000-እጥፍ ዲሉሽን፤ ሮቼ፣ የካታሎግ ቁጥር፡ 11 093 274 910) በመጠቀም የበሽታ መከላከያ ምርመራ ተደርጎባቸዋል፣ እና ክፍሎቹ በ5-ብሮሞ-4-ክሎሮ-3-ኢንዶሊል ፎስፌት (BCIP፣ 250-እጥፍ ዲሉሽን)/ናይትሮብሉ ቴትራዞሊየም (NBT፣ 200-እጥፍ ዲሉሽን) መፍትሄ ተተክለዋል።